[发明专利]一种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法。

背景技术

DNA分子标记技术是研究茶树起源、分子演化、遗传多样性、品种鉴定的一个重要工具。而进行这些研究的先决条件是高质量基因组DNA的提取。由于茶树叶片富含酚类物质，鲜叶中酚类物质含量可达干物质总量的18％～36％，且含有大量的生物碱及其它多种次生物质，这就给为DNA的提取带来了极大困难，如酚类物质可引起DNA降解、变色并影响后续分析，残存的多糖能抑制PCR反应。

目前常见的茶树基因组DNA提取方法有SDS法及CTAB法，虽然这些方法可以成功地从茶树幼叶、成熟叶片提取基因组DNA，但是这些提取方法通常使用有毒试剂氯仿/苯酚去除DNA上残留蛋白质及其他污染物，而且这些方法的操作步骤繁琐，耗时过长，通常在3小时以上。另外，由于茶树不同叶龄间次生代谢产物的异质程度都较高，导致了上述这些提取方法往往不能很好地应用于茶树老叶片基因组DNA提取，而且目前现有技术还没有专门针对茶树老叶片基因组DNA提取的方法的报道。

因此，我们迫切地需要构建一个安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在不适合老叶片、使用有毒试剂及耗时长的缺点和不足，针对茶树老叶富含多酚、多糖的特点，提供一种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法。

本发明的技术方案如下：

一种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法，包括以下步骤：

(1)将0.3g茶树叶片于液氮研磨至粉末状，再加入800μL预热DNA提取缓冲液，摇匀后于65℃水浴30min；所述DNA提取缓冲液由1.5％(w/v)SDS(pH 5.5)，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，40mmol/L EDTA(pH8.0)，1mol/L NaCl，2.5％PVP，10mmol/L β-巯基乙醇组成；所述茶树叶片为新鲜的茶树老叶片；

(2)加入125μL 5mol/LKAC，摇匀后冰浴20min；

(3)待反应充分后，1.2×10⁴r/min离心3min，将上清液加入吸附柱中并装入收集管，1.2×10⁴r/min离心1min；

(4)将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管，1.2×10⁴r/min离心1min，弃废液；

(5)向吸附柱加入800μL的70％乙醇，1.2×10⁴r/min离心1min，弃废液；

(6)再次加入800μL的70％乙醇，1.2×10⁴r/min离心1min，弃废液；

(7)重新将吸附柱装入收集管中，1.2×10⁴r/min离心3min，除去剩余乙醇；

(8)取出吸附柱，于50℃放置5min；

(9)将吸附柱放入新离心管中，加入60μL TE，于40℃放置5min，1.2×10⁴r/min离心3min；离心管中液体为提取的茶树基因组DNA。

所述的方法，步骤(1)中，液氮研磨后迅速加入DNA提取缓冲液。

茶树老叶富含次生代谢物质，如酚类物质可引起DNA降解、变色并影响后续分析，残存的多糖能抑制PCR反应。为了消除这些影响，采取以下做法：①改变DNA提取缓冲液组成，加入2.5％PVP、10mmol/L β-巯基乙醇来防止茶树叶片中的多酚化合物氧化褐变，加入1mol/L NaCl来增加提取液中DNA的含量；②在裂解后，加入5mol/L KAC去除大量多糖；③采用吸附柱特异结合DNA来纯化所提DNA，进一步控制了所提DNA溶液中的多糖含量及防止酚类物质进入所提DNA溶液。因此，本发明的方法可以从茶树老叶片提取高质量的基因组DNA，满足后续的PCR分析。

(1)本发明可以从新鲜茶树老叶片提取高质量的基因组DNA。

(2)与已有的SDS、CTAB法相比，本发明可以通过特异性结合DNA的吸附柱纯化DNA，消除有毒有害试剂酚/氯仿的使用，保护操作人员的身体安全。

(3)与已有的SDS、CTAB法相比，本发明可以快速提取茶树叶片基因组DNA，用时短，在2小时内可以完成，而已有方法用时3～4小时。

附图说明

图1为采用本发明方法提取茶树老叶片DNA的电泳图。