[发明专利]一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于含有以下组分：

（1）、吡喹酮标准溶液：

（2）、辣根过物氧化酶标记羊抗兔抗体溶液；

（3）、吡喹酮抗血清；

（4）、浓缩洗涤液；

（5）、显色液；

（6）、终止液；

（7）、已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量反应板；

（8）、空白聚苯乙烯微量反应板。

2.如权利要求1所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的吡喹酮抗血清通过如下方法制备，其制备过程具体包括如下步 骤： 

①、10mg吡喹酮加入0.15ml 1N HCl中，油浴升温至120℃回流反应3h，反应结束后，冷却放置，待底部油状物固化后，倒出上层水层，用NaHCO₃调节pH至9.0，二氯甲烷40ml*3萃取该水相,无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物；

②、将4-氨基环己烷羧酸10mg,和NaCO₃12mg,溶解到75ml蒸馏水中，然后滴加苄氧基羰酰氯16mg，在室温下剧烈搅拌3h至产生沉淀，以3号砂芯漏斗过滤分离出的沉淀，以乙醚洗涤3次，然后溶入100 ml1 N HCl中，先以0.15ml乙醚提取1次，再用100ml、100ml乙醚提取2次，合并提取物以1NHCl 50ml、50ml、50ml洗3次，过无水NaSO₄柱脱水，50℃真空浓缩至干得白色粉末；

③、取步骤①所得的产物0.5mg与步骤②所得的白色粉末0.72mg用30ml二氯甲烷溶解，再加入0.76mg环已基碳二亚胺，0.39mg4-（N,N-二甲基氨基）吡啶,常温反应过夜，反应结束后生成白色固体，抽滤，所得的滤液用10ml1N HCl洗涤，再旋转蒸发得黄色固体，用甲醇：二氯甲烷为1：10的展开剂进行薄层板分离纯化；

④、将步骤③所得的黄色固体经薄层分离纯化后的产物0.5mg，钯碳0.2mg，置于圆底烧瓶中，抽真空，充氢气;加入15ml甲醇,常温反应2-3h，过滤去除钯碳，以甲醇：二氯甲烷为1：10的展开剂进行薄层板分离纯化得到吡喹酮氨；

⑤、免疫原的制备

称取0.01mg BSA溶于1ml，浓度为100mM，pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，再加入0.01mg丁二酸酐，常温反应3h；

上述常温反应3h后的产物分别用500ml*3，浓度为100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲溶液透析3天，每4h更换缓冲液；

在上述透析后的产物中加入0.004mg碳二亚胺盐酸盐和0.004mgN-羟基琥珀酰亚胺,再加入步骤④所得的吡喹酮胺0.008mg，4℃反应3h；

上述4℃反应3h后的产物用含8mg氯化钠的1000ml*3，浓度为10mM，pH7.0的磷酸盐缓冲溶液透析3天，透析好的产物即为免疫原即吡喹酮胺-BSA；

⑥、吡喹酮抗血清制备

选用临床健康，体重1.5—2Kg的新西兰雄性兔4只，第一次免疫用1mL弗氏完全佐剂加1ml步骤⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA皮下或皮内多点注射，此后每间隔四周用1ml弗氏不完全佐剂加1mL步骤⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA，前后共免疫5次，最后一次免疫后10天宰杀，采血，分离出血清即得吡喹酮抗血清。

3.如权利要求2所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的吡喹酮标准溶液的浓度分别为250，125，31.3，20，7.8，0ng/ml。

4.如权利要求3所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，

其特征在于所述的浓缩洗涤液为0.2M/L磷酸盐-吐温20缓冲液。

5.如权利要求4所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的显色液为3，3，5，5四甲基联苯胺—H₂O₂溶液。

6.如权利要求5所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的终止液为2mol/LH₂SO₄溶液。