[发明专利]一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物源性食品中药物残留的检测方法及试剂盒，具体是一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫快速检测试剂盒及其检测方法。 

背景技术

吡喹酮（praziquantel），化学名称为（a pyrazinoisoquinoline derivative:(2-(cyclohexyl-carbonyl)-1,2,3,6,7,11bhexahydro-4H-pyrazino [2,1-a] isoquinoline-4-one)，是人工合成的杂环类驱虫药剂，可治疗血吸虫、肺吸虫、华支睾吸虫及绦虫等感染，吡喹酮在国内使用普遍， 2002.12.24实施的农业部公告第235号附件“动物性食品中兽药最高残留限量”规定 吡喹酮可用于马、山羊和 非泌乳绵羊，我国至今尚未制定残留限量标准。而2006年已开始实施的“日本肯定列表”规定了65种动物源性食品中吡喹酮的最低限量暂定标准，其中只有9种为0.3 mg/Kg，其他均在0.02-0.05mg/Kg之间，欧盟规定牛肉、猪肉、鸡肉、鱼肉和其他动物可食用组织中的最高残留限量≤0.02mg/Kg。 

吡喹酮的检测国外已经高效液相色谱方法等仪器方法进行检测，最低检测限达到10ppb,但是这些方法需要仪昂贵，检测时间长，耗材价格高，操作者技术要求高，有的方法废弃物处理困难，不太适合基层对大量样品的快速检验免疫学快速检测（ELISA）法检测吡喹酮目前国内外未见报道。 

发明内容

本发明的目的是为了解决上述的技术问题而提供一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，该检测试剂盒及检测方法不需要复杂昂贵的仪器设备，操作简便，动物源性食品前处理简单，检测快速，检测容量大，成本低廉等特点，适合大批量动物源性食品筛选的定性、定量检测的优点，并具有潜在的广泛的应用价值。 

本发明的技术原理 

本发明的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒对动物源性食品中吡喹酮含量进行检测的原理是抗原抗体结合反应。即将吡喹酮标准品、待测动物源性食品的提取液及特异性抗血清进行抗原抗体结合反应后，加入到用包被抗原包被的酶标条中反特异性抗血清进行竞争性的结合，在吡喹酮优先的原则下，吡喹酮含量与特异性抗血清结合的份额就多，剩余的特异性抗血清与包被抗原结合的份额就少，呈梯度变化，吡喹酮与特异性抗血清的结合物在反应孔中呈游离状态，而包被抗原与酶标记特异性抗体结合物则附着在反应孔的壁上，前者随洗涤步骤而洗去，后者被底物显色，呈蓝色。包被抗原与特异性抗体结合的多少与半抗原的含量呈反比，半抗原含量越多，吸光度值（OD）越低，根据OD值的变化则可以在标准曲线上查找到相应的位置，从而计算出动物源性食品中吡喹酮准确的含量。 

本发明的技术方案 

一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，含有以下组分：

（1）、吡喹酮标准溶液：250，125，31.3，20，7.8，0ng/ml：

由标准吡喹酮按不同比例定容于0.01M/L磷酸盐-吐温20缓冲液溶液中即得到浓度分别为250、125、31.3、20、7.8、0ng/ml的吡喹酮标准溶液；

（2）、辣根过物氧化酶标记羊抗兔抗体溶液（HRP-IgG）：

市售，浓度1:100；使用前用稀释成1:5000；

（3）、吡喹酮抗血清：1:100储存液备用，使用前用稀释成1:1500；

所述的吡喹酮抗血清通过如下方法制备，其制备过程具体包括如下步 骤： 

①、10mg吡喹酮加入0.15ml 1N HCl（盐酸）中，油浴升温至120℃回流反应3h，反应结束后，冷却放置，待底部油状物固化后，倒出上层水层，用NaHCO₃调节pH至9.0，二氯甲烷40ml*3萃取该水相,无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物；

②、将4-氨基环己烷羧酸10mg,和NaCO₃12mg,溶解到75ml蒸馏水中，然后滴加苄氧基羰酰氯16mg，在室温下剧烈搅拌3h至产生沉淀，以3号砂芯漏斗过滤分离出的沉淀，以乙醚洗涤3次，然后溶入100 ml1 N HCl中，先以0.15ml乙醚提取1次，再用100ml、100ml乙醚提取2次，合并提取物以1NHCl 50ml、50ml、50ml洗3次，过无水NaSO₄柱脱水，50℃真空浓缩至干得白色粉末；