[发明专利]桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物及用途

说明书

技术领域

本发明属于药物筛选方法领域，涉及桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，尤其涉及应用磁珠分离和液相色谱-质谱联用及核磁共振分析技术从桑叶中获得具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，并在制备治疗糖尿病药物中的应用。

背景技术

糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病，其主要的干预方法是控制饮食、减少摄入性碳水化合物的含量、药物治疗等。人体摄入的碳水化合物经过小肠上皮细胞的酶（如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的水解作用生成葡萄糖之后，才被吸收进入血液循环。阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制剂可以抑制α-葡萄糖苷酶，减少碳水化合物转化成葡萄糖，是一类临床常用的糖尿病治疗药物。现有的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法主要采用体外酶活性抑制实验，仅能对纯化合物的活性进行评价，难以用于中药等复杂混合物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。

亲和选择技术联用质谱分析方法可以快速分析与鉴定与特定蛋白或酶结合的配体化合物，如将特定蛋白或酶加入待筛选的样品中使用超滤膜把蛋白结合物与未结合的化合物分离开，再进行质谱检测；或是把特定蛋白或酶固定在色谱固定相中，使用洗脱溶剂把化合物按照与蛋白的结合强弱依次洗脱下来，进行质谱检测；还可将特定蛋白或酶固定在某种合适的载体上，与配体化合物作用后，把不结合的部分洗脱掉，然后把结合配体洗脱出来，进行质谱检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，该化合物通过以下步骤实现： 

（1）制备键合α-葡萄糖苷酶的磁珠

（a）磁珠活化：取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30 min后移去上清液，并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；

（b）磁珠键合：在活化的磁珠上，加入含α-葡萄糖苷酶的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，震荡混合均匀，在室温孵育30 min进行包被，移去上清液，再用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗包被的磁珠4次，弃去清洗液，待用。

（2）键合磁珠质量考察：将制备的键合磁珠分散在PBS溶液中，使用扫描式电子显微镜对α-葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别进行扫描成像，检查磁珠键合情况，磁珠表面不粗糙、较光滑的表明键合情况良好。

（3）筛选具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物

（a）具潜在α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初筛：取30μl桑叶提取物水溶液2份，分别加到1ml 分散于醋酸铵溶液的键合α-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠，放在振荡器上混匀，孵育1 h。弃去上清液，再加入1ml醋酸铵溶液清洗2次，弃去清洗液，最后使用含10%乙腈的醋酸铵溶液洗脱，吸取洗脱液备用，平行操作三份，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相分析及液质鉴定，洗脱液浓缩后，用氘代二甲基亚砜（DMSO）溶解，做核磁共振氢谱分析；

（b）目标化合物获取及活性验证

采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置相对应的目标化合物；

采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。

所述化合物为异槲皮素和紫云英苷。

本发明的另一个目的是提供从桑叶中筛选获得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物在制备抗糖尿病药物中的应用。

本发明通过一种快速筛选桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的方法，提供一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物。与传统方法相比，初筛无须制备分离化合物，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间，减少了标的化合物制备分离步骤。此外，本筛选方法具有快速、准确、重现性好等特点。可推广用于天然药物或中药混合物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速筛选。本发明方法获得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物可在制备抗糖尿病药物中应用。 

附图说明

图 1 磁珠电镜图，A：空白磁珠，B：α-葡萄糖苷酶键合磁珠。

图 2桑叶磁珠结合洗脱液液相色谱图。

图 3桑叶磁珠结合洗脱液液相色谱-质谱图，其中图3-1和图3-2分别为峰8的光谱图与质谱图，图3-3和图3-4分别为峰10的光谱图与质谱图。

图4 桑叶磁珠结合洗脱液核磁共振氢谱图。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例进一步说明本发明的实质内容及有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。