[发明专利]检测炭疽杆菌的引物、双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒及快速可视化检测方法

权利要求书

1.一种用于LAMP检测炭疽杆菌的引物，其特征是，包括lef引物序列集和gyrB引物序列集；其中，

lef引物序列集包括外引物对LF-F3和LF-B3，以及内引物对LF-FIP和LF-BIP；LF-F3的序列如SEQ ID NO:1所示，LF-B3的序列如SEQ ID NO:2所示，LF-FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，LF-BIP的序列如SEQ ID NO:4所示；

gyrB引物序列集包括外引物对gy-F3和gy-B3，内引物对gy-FIP和gy-BIP，以及环引物对gy-LF和gy-LB；gy-F3的序列如SEQ ID NO:5所示，gy-B3的序列如SEQ ID NO:6所示，gy-FIP的序列如SEQ ID NO:7所示，gy-BIP的序列如SEQ ID NO:8所示，gy-LF的序列如SEQ ID NO:9所示，gy-LB的序列如SEQ ID NO:10所示。

2.一种双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒，其特征是，包括权利要求1所述用于LAMP检测炭疽杆菌的引物。

3.根据权利要求2所述双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒，其特征是，还包括2×反应缓冲液，所述反应缓冲液含有30-60mmol/L pH8.8的Tris-HCl，16-30mmol/L的KCl，10-30mmol/L的(NH₄)₂SO₄，质量浓度为0.1-0.3%的TritonX-100，由浓度均为2.0-3.6mmol/L的dATP、dTTP、dCTP、dGTP组成的dNTPs，0.1-2.0mmol/L的甜菜碱C₅H₁₁NO₂，以及14-18mmol/L的MgCl₂。

4.根据权利要求3所述双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒，其特征是，还包括浓度为6-12U/μl的BstDNA聚合酶，以及浓度为2-20mmol/L的金属离子指示剂HNB储存液。

5.根据权利要求4所述双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒，其特征是，还包括阳性对照品：浓度为20-100mg/L的含有炭疽杆菌lef基因片段及gyrB基因片段的质粒PGEM-lef-gyrb。

6.一种双重LAMP检测炭疽杆菌的快速可视化检测方法，其特征是，采用权利要求5所述双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒，该方法包括以下步骤：

第一步、向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2×反应缓冲液、I管或Ⅱ管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B；其中反应管A中加入I管的引物混合液，反应管B中加入Ⅱ管的引物混合液；试剂盒2×反应缓冲液、I管或Ⅱ管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水的体积比为（8-12）：（1.5-3.5）：（0.5-1.5）：（0.3-0.9）：（3.1-4.7）；

第二步、向反应管A、B中分别加入体积相同的待测核酸样品，盖好反应管A、B后混匀；

第三步、将反应管A、B先分别在60℃-64℃恒温条件下放置45-80min进行LAMP扩增，再置于80℃-95℃5-10min灭活BstDNA聚合酶；

第四步、观察反应液A、B的颜色，若两者颜色均为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有炭疽杆菌强毒株或弱毒株；若两者颜色均为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源不含炭疽杆菌；若反应液A颜色为紫罗兰色，且反应液B颜色为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有炭疽杆菌弱毒株或无毒株；若反应液A颜色为天蓝色，且反应液B颜色为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源含有具有毒性质粒pX01的蜡样芽胞杆菌。

7.一种针对权利要求5所述双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒的检验方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步、制备两套含反应液A的反应管A、含反应液B的反应管B：向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2×反应缓冲液、I管或Ⅱ管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B；其中反应管A中加入I管的引物混合液，反应管B中加入Ⅱ管的引物混合液；试剂盒2×反应缓冲液、I管或Ⅱ管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水的体积比为（8-12）：（1.5-3.5）：（0.5-1.5）：（0.3-0.9）：（3.1-4.7）；

第二步、向第一套反应管A、B中分别加入体积相同的蒸馏水，盖好反应管A、B后混匀，作为阴性对照；向第二套反应管A、B中分别加入体积相同的阳性对照品，盖好反应管A、B后混匀，作为阳性对照；蒸馏水、阳性对照品的加入体积相同；

第三步、将反应管A、B先分别在60℃-64℃恒温条件下放置45-80min进行LAMP扩增，再置于80℃-95℃5-10min灭活BstDNA聚合酶；

第四步、观察阴性对照反应液A、B和阳性对照反应液A、B的颜色，若阴性对照反应液A、B颜色均为紫罗兰色，且阳性对照反应液A、B颜色均为天蓝色，则第一步所用试剂盒是正常的；若各反应液颜色与前述情况不完全相符或完全不相符，则第一步所用试剂盒不正常。