[发明专利]检测炭疽杆菌的引物、双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒及快速可视化检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于以LAMP法检测炭疽杆菌的引物、含有该引物的试剂盒、采用该试剂盒的检测方法、以及针对该试剂盒的检验方法，属于生物技术领域。 

背景技术

炭疽杆菌是人畜共患致病菌，可通过皮肤接触、呼吸道及消化道感染人和动物，具有高度致病性，其中肺炭疽被列为中国国家法定甲类传染病（最高级别）。炭疽杆菌可通过空气飞沫传播，可形成气溶胶，易引发突发公共卫生事件；而炭疽杆菌芽孢可存活十年以上，可构成公共卫生隐患。炭疽杆菌严重威胁人类健康和生命安全，其检测和预防一直倍受重视。 

然而，目前的检测方法面临两个主要问题：一是如何在条件较简陋的事发现场快速确定是否存在炭疽杆菌；二是如何快速诊断出炭疽强毒株，以挽救吸入性感染炭疽强毒株的病人生命，同时确定针对目标人群的强制性隔离防疫措施等。 

传统炭疽杆菌的检测诊断都是基于形态学特征或表型特征，如革兰氏阳性染色试验、噬菌体试验、串珠和青霉素抑制试验、拉丝试验〈粘型菌落〉、溶血试验、芽孢形成试验等，这些方法在一定程度上都存在着费时、操作繁琐、灵敏度低等缺点，均不适合早期快速侦检。 

现有技术中，免疫胶体金技术、常规PCR及DNA探针杂交技术，均存在特异性和敏感性的问题；实时荧光定量PCR技术灵敏度高，可靠性好，是全封闭反应，但是该技术需要价格昂贵的荧光定量PCR仪，无法在很多中小医院和基层防疫机构普及，且为了保证高特异性往往需要荧光标记探针，检测成本较高。此外，精密贵重仪器对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，难以在疫情现场使用。 

2000年，日本学者Notomi等开发出一种新技术——LAMP法（环介导等温扩增法），扩增反应全过程均在同一温度下进行，不须像PCR反应那样需要经历几十个温度变化的循环过程，因此对扩增所需仪器的要求大大简化，仅需水浴锅或其它小型恒温加热器即可，并且反应时间缩短。 

LAMP法的基本原理是：针对靶基因的6个区域设计4~6条引物（包括2条内引物和2条外引物，可另加2条非必需的环引物），在具有链置换特性的Bst DNA聚合酶作用下，外引物的延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA，然后进入循环扩增阶段，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物。 

LAMP法具有以下优点：（1）较高特异性和抗干扰能力，只有当2对引物与目的片段的6个区域都匹配上时才能进行扩增；（2）反应体系稳定可靠，在室温下放置2周后仍然稳定，并且对于样品中原有或污染的无关、干扰片段仍然不敏感，而其他类似技术则无法做到这一点；（3）敏感性较高，扩增快速、高效，1小时内产物量可达约10¹⁰倍，约为普通PCR的1000倍。因此，LAMP法为病原微生物的核酸检测提供了一个更简便、更快速、更有效的手段，尤其适用于疫情现场、野外工作、基层单位等条件相对简陋的环境。 

但是，目前应用于病原体检测的LAMP法，几乎都存在一个关键问题：LAMP扩增产物的检测手段主要是扩增结束后开盖加入荧光染料SYBR Green I等显色液，但在此过程中，很难避免核酸气溶胶污染所致的后续假阳性结果。出现假阳性的主要原因是：由于扩增结束后核酸片段产物量过于巨大，往往又是同一片段的重复序列，加热后会形成气溶胶，开盖后即挥散在空气、尘埃中以及器皿、衣物、工作台和耗材试剂等表面，而LAMP方法又过于灵敏，气溶胶污染后将造成后续检测的高假阳性率。日本荣研公司的LA-320实时浊度仪专用于LAMP法，可实时监测浊度变化，无需开盖，可避免前述假阳性现象，但该仪器价格昂贵约60万元，限制了其推广应用。 

此外，值得注意的是，现有利用某单一基因鉴定炭疽杆菌的方法并不完 全可靠：炭疽杆菌与枯草芽孢杆菌等其它蜡样菌群有很高的同源性，重要区别在于炭疽杆菌含有2个与毒力密切相关的特异性质粒(pX01和pX02)；pX01质粒上包含分别编码致死因子、保护性抗原、水肿因子的lef、PA和cya基因，pX02质粒上则包含与芽孢形成有关的基因如capA、capB、capC基因。目前已有的炭疽杆菌核酸检测方法基本上都会检测这些质粒上的特异致病因子，但是炭疽杆菌的质粒并不稳定，容易缺失而使炭疽杆菌成为弱毒株或无毒株，而且自然环境下这些质粒可被导入其它菌株，即在普通蜡状芽胞杆菌群间水平转移。相较之下，炭疽杆菌的染色体表达相对稳定，可在准确鉴定中发挥重要作用。