[发明专利]梅毒螺旋体IgM抗体胶体金法检测试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种用胶体金免疫层析法检测梅毒螺旋体IgM抗体的试剂及其制备方法。

 

背景技术

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum, TP) 感染引起的慢性疾病，是性病中危害性比较严重的疾病，可通过性、血液和母婴途径传播。梅毒螺旋体危害心血管系统，可导致主动脉炎、主动脉瓣闭锁不全、主动脉瘤等，也可损害骨骼系统，引起组织和器官破坏，功能丧失，导致残疾或死亡；通过胎盘传染胎儿后，可导致自发性流产、死产或先天梅毒等，母孕早期感染者胎儿40% -50%感染, 常常导致死胎、死产、流产、早产或胎儿生长受限。因此，梅毒在性传播疾病中其危害性和致死率仅次于艾滋病, 它还可垂直传播, 严重影响婴幼儿健康，已成为一大严峻的社会公共卫生问题。

血清学检测是目前诊断梅毒的重要实验室检测方法。目前梅毒的血清学检测方法主要有两种：一类是非梅毒螺旋体抗原血清试验，如快速血浆反应素环状卡片试验、甲苯胺红不加热血清试验等，常用作梅毒的筛查试验。由于此类试验受多种因素影响，常出现生物学假阳性和假阴性结果，对一、三期梅毒的阳性检出率不高，仅适用于二期梅毒的诊断。另一类是梅毒螺旋体抗原血清实验，如梅毒螺旋体血球凝集试验、明胶凝集试验、荧光密螺旋体抗体吸收试验及酶联免疫吸附试验等，这类试验的敏感性高、特异性强，临床常用来作为梅毒的确认试验。但是此类试验检测的是梅毒螺旋体IgG抗体和IgM抗体，而IgG抗体长期存在，血清反应持续存在阳性，且可以通过胎盘, 被动免疫胎儿, 且可持续多年甚至终生；因而不能区分新生儿血清抗体反应是否来自母亲还是胎儿本身，也不能用作梅毒治疗的疗效观察。

梅毒感染后，IgM抗体是机体最先出现的体液免疫应答，一般感染2周即可从血清中检出，并且只要有活的梅毒螺旋体存在，IgM抗体就会维持在一定的水平。有报道称IgM抗体100%转阴，在一期梅毒为3个月、二期梅毒为9个月、早期隐性梅毒为2年。因此， TP-IgM 可以看作是梅毒早期感染并活动的一项血清学标志。

IgM 抗体检测在国外早已被推荐作为早期先天性梅毒的确证试验,而目前国内虽然有少量对早期梅毒的诊断、梅毒的确认及疗效监控方法的研究，但需先分离IgG抗体，以防止IgG与IgM抗体竞争特异性抗原结合位点，导致IgM抗体的假阴性。由于对IgG抗体、IgM抗体分离技术尚没有完全掌握，没有形成商品化产品，临床所用相关试剂盒基本上为进口，给病人和社会带来较大的经济负担，不便于对梅毒的早期诊断、确认和控制。

使用胶体金作为示踪物的胶体金免疫层析法检测梅毒螺旋体IgM抗体未见相应的商业化试剂，该方法操作简便、快速、稳定性好，易于进行单份样本检测，且不需特殊仪器进行检测，由于示踪物为固相易于保存、稳定性好。

 

发明内容

本发明的目的是为了克服当前检测梅毒螺旋体IgM抗体技术在推广使用中存在的需预先进行IgG和IgM抗体分离的缺陷，提供一种操作简便、不需要特定仪器设备辅助、不需要对检测人员进行特殊培训的快速检测试剂并且有效降低检测成本，同时提供该试剂的制备方法。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种梅毒螺旋体IgM抗体胶体金法检测试剂，该试剂包括金结合物垫（3）、硝酸纤维素反应膜（4）、样品垫（2）、吸水纸（5）和PVC背衬（1）；将样品垫、金结合物垫、硝酸纤维素反应膜和吸水纸顺次相互叠压粘附于PVC背衬上；样品垫叠压金结合物垫2-3mm，金结合物垫叠压硝酸纤维素反应膜2-3mm，吸水纸叠压硝酸纤维素反应膜2-3mm；金结合物垫上包被了抗人IgM单克隆抗体-胶体金的结合物，硝酸纤维素反应膜质控区（7）和检测区（6）位置上分别包被了羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体和特异性的基因重组梅毒螺旋体抗原。

所述的样品垫是包被了葡萄球菌A蛋白(SPA)的玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜。

所述检测区包被的梅毒螺旋体抗原为纯化的特异性基因重组抗原。

该试剂的制备方法包括以下步骤：

A：制备抗人IgM单克隆抗体：取多份正常人血清，混合，经透析、离心、纯化制得纯度达95%的IgM抗体，以人IgM作为抗原，经脾内注射免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠，取小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选择性培养、筛选及克隆化获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞接种于BALB/c小鼠腹腔制备腹水，以亲和层析法提纯鼠抗人IgM单克隆抗体；