[发明专利]文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因（cDNA全长序列和氨基酸序列）的扩增、表达及其应用。

背景技术

文蛤（Meretrix meretrix）是一种重要的海水增养殖滩涂贝类，主要分布于朝鲜、日本、越南、印度和中国沿海。在我国主要分布于辽宁辽河口、山东黄河口、江苏长江口和广西的北海等海区，是我国主要的出口鲜活水产品之一。近十年来，由于病害等原因，特别是红肉病的蔓延，文蛤增养殖业的发展受到严重制约。因此，对文蛤病害特别是其自身免疫抗性的研究，已经成为解决文蛤产业瓶颈的重要途径。

作为一种重要的免疫相关基因，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），是生物体内一种重要的抗氧化酶，对于清除活性氧自由基（reactiveoxygenspecies，ROS），防止活性氧自由基破坏细胞的组成、结构和功能，保护细胞免受氧化损伤具有十分重要的作用，对生物体防御毒性起着关键作用。SOD按其结合的金属离子的不同，主要可分为3类：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD，其中铜锌超氧化物歧化酶在生物体内分布相对广泛，也是目前为止研究得最多的超氧化物歧化酶。已有研究表明铜锌超氧化物歧化酶在生物体内有胞内形式（icCu/Zn-SOD）和胞外形式（EC-SOD）两种。

Cu/Zn-SOD与贝类免疫水平密切相关，能够增强吞噬细胞防御能力和整个机体的免疫功能，使细胞免受ROS的毒害。由于Cu/Zn-SOD的存在，健康水生动物体内环境中的活性氧自由基能够维持在有利无害的较低水平。但是当Cu/Zn-SOD活性降低时，生物体内自由基量就会过多，势必打破这种有利状态，因此，Cu/Zn-SOD在贝类中是一种十分重要的免疫相关基因。孙虎山等对栉孔扇贝中的铜锌超氧化物歧化酶的活性和性质进行了研究，证明了Cu/Zn-SOD的高稳定性和栉孔扇贝可作为SOD的提取材料。Ni等通过同源克隆的方法得到了栉孔扇贝铜锌超氧化物岐化酶cDNA全长，并通过菌刺激后的RT-PCR实验得出了Cu/Zn-SOD是一种诱导型急性免疫蛋白，并能在鳗弧球菌属及光球菌感染的免疫反应中发挥重要作用。包永波等通过研究，得到了海湾扇贝Cu/Zn-SOD基因的全长，并分析出海湾扇贝Cu/Zn-SOD基因包含4个外显子和3个内含子，并通过菌刺激实验和体外表达证实了海湾扇贝Cu/Zn-SOD在免疫防御中的重要作用。Li等人2010年通过同源克隆及RACE克隆得到了菲律宾蛤仔的细胞内铜锌超氧化物岐化酶（VpSOD）cDNA全长，并通过鳗弧菌刺激实验得出了VpSOD蛋白为诱导型急性免疫蛋白的结论。而目前还未见文蛤Cu/Zn-SOD基因方面的研究报道。

发明内容

本发明利用构建cDNA文库、EST分析和3′RACE技术，对文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因进行了研究，首次从文蛤中克隆到胞内铜锌超氧化物歧化酶基因，本发明通过以下技术方案实现：

本发明从文蛤中克隆到胞内铜锌超氧化物歧化酶基因，它具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列，其编码蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明克隆得到的文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因，该基因cDNA全长1383bp，5′UTR为45bp，3′UTR为876bp，有一个462bp开放阅读框，编码153个氨基酸，Cu原子分别与His46、His48、His63、Hisll9配位，Zn则与His63、His71、His80和Asp83配位，半胱氨酸Cys57和Cys145之间形成唯一的链内二硫键。蛋白质结构中心是由8条反向平行的β折叠围成的圆桶状结构。有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴；该基因在文蛤免疫防御方面具有重要功能。

本发明的另一方面在于，构建一种重组文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的质粒，其将SEQ ID NO.1的碱基序列所对应的基因片段连接至表达载体PET-30a中，构建重组表达质粒。

本发明的另一方面在于，构建一种表达文蛤胞内铜锌超氧化物歧化酶的基因工程菌，其将SEQ ID NO.1的碱基序列所对应的基因片段连接至表达载体PET-30a中，构建重组表达质粒。并将所述的质粒转化大肠杆菌DH5α宿主细胞获得重组基因工程菌。

本发明的另一方面在于，公开一种从文蛤中克隆到胞内铜锌超氧化物歧化酶基因的方法，其具体步骤包括：

（1）文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化；其中，所述文蛤总RNA的提取的模板是从感染了鳗弧菌的文蛤血淋巴中提取的总RNA。

（2）文蛤cDNA文库构建及序列的测序；