[发明专利]同时检测鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌的方法

权利要求书

1.一种采用连接多克隆抗体的磁珠收集目标菌、叠氮溴化丙锭（PMA）处理和多重PCR相结合的同时检测鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、大肠杆菌（Enteroheamorrhagic E.coli）O157:H7和单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的方法。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法包含下列步骤：

（1）任选地，制备鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌的多克隆抗体并纯化；

（2）将纯化的鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌的多克隆抗体与表面羧基化的纳米磁珠偶联，将所述偶联的免疫磁珠与检测样本接触，收集目标菌，并将磁珠分离，洗脱，收集洗脱液；

（3）用PMA处理所述洗脱液，离心，收集菌体沉淀并提取DNA；和

（4）对所得DNA进行多重PCR检测，以确定目标菌是否存在。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多重PCR中所使用的引物如下：目标菌为鼠伤寒沙门氏菌的引物对fliC-F:CGCTGTTGACCAGAATAACCT和fliC-R:TCCTTACCACCCTTAATGGCAC、目标菌为大肠杆菌O157:H7的引物对rfbE-F:TTTATACGGACATCCATGTGA和rfbE-R:TTAATTCCACGCCAACCA和/或目标菌为单核增生李斯特菌的引物对hly-F:TGAATGCAATTTCGAGCCTA和hly-R:CGCCGAAGTTTACATTCAAGC。

4.如权利要求3所述的方法，所述方法包括：

（a）在无菌操作下，获取检测样本，加入缓冲液碾磨制成匀浆液，离心，取上清获得样本液，其中所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液；

（b）取表面羧基化的纳米磁珠，乙醇和无菌pH5.0~6.5，优选pH5.5~6.0，更优选pH5.7的脂肪酸甲酯磺酸盐-吐温缓冲液（MEST）洗涤后，加入二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHSS），20℃~30℃，优选22℃~28℃，更优选25℃下振荡活化，磁分离后移除上清，用无菌pH5.0~6.5，优选pH5.5~6.0，更优选pH5.7MEST洗涤后收集磁珠，取纯化的鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌多克隆抗体，将pH调整到8.3~9.2，优选8.5~9.0，更优选8.7，迅速加入到活化后磁珠里，20℃~30℃，优选22℃~28℃，更优选25℃振荡反应2~4h，优选2.5~3.5h，更优选3h，磁分离，获取偶联了抗体的免疫磁珠，用MEST洗涤，备用；

（c）将所述免疫磁珠加入所述样本液中收集目标菌，分离磁珠并洗脱，收集洗脱液，之后加入PMA溶液，使PMA的终质量浓度为2.5~3.5μg/mL，优选2.8~3.2μg/mL更优选3μg/mL，混匀，将混合后的样本液20℃~30℃，优选22℃~28℃，更优选25℃下避光培养280~320秒，优选290~310秒，更优选300秒，利用500W的卤素灯曝光280~320秒，优选290-310秒，更优选300秒，光照交联时所述混合后的样本液置于冰上，且在距光源20cm处，交联后的悬浮液离心，将获得的沉淀进行DNA提取，其中，优选地用沸水浴法进行DNA提取；和

（d）所得DNA进行多重PCR，以确定所述检测样本中是否有目标菌。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于所述多重PCR之后用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，其中若有784bp条带，则有鼠伤寒沙门氏菌存在，若有627bp条带，则有大肠杆菌O157：H7存在，若有360bp条带，则有单核增生李斯特菌存在。

6.一种用于同时检测鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和单核增生李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包含分别以鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌为目标菌的引物对。

7.如权利要求6所述的试剂盒，所述试剂盒还包含纯化的鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌的多克隆抗体。