[发明专利]同时检测鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及一种检测方法，尤其涉及一种同时快速检测鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、大肠杆菌（EnteroheamorrhagicE.coli）O157:H7、单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的方法。 

背景技术

鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌均是在食品和饮水中经常被发现的致病菌类，也是人类最常见的三大感染源，对人类健康造成了严重的危害。 

沙门氏菌是全世界引发胃肠炎最主要的一种致病菌，每年可引起140万人发病，同时沙门氏菌病也是最重要的人畜共患病之一，它几乎可以适应几乎任何类型的宿主。沙门氏菌污染的食品和饮水是人类受感染的一个主要来源。其中，鼠伤寒沙门氏菌是引起食物中毒和沙门氏菌病的一种重要的致病菌，它主要流行在发展中国家，对于免疫缺陷性个体而言鼠伤寒沙门氏菌感染常常是致命的。鼠伤寒沙门氏菌主要在肠道内增殖，粘附于肠黏膜上皮细胞，进而侵入固有层，释放毒素，导致其出现充血、水肿、点状出血等急性炎症反应。其临床表现多样，免疫功能正常者多表现为胃肠炎型。而在婴幼儿及体弱者中，则会在发生胃肠道症状之后出现败血症，并进一步引发内脏损害。 

大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌的主要致病菌株，每年也会引发多起食物中毒事件，1982年首次在美国发现O157:H7大肠杆菌引起的出血性肠炎的暴发，1996年在日本引起了世界上最大的一次暴发流行。大肠杆菌O157:H7 进入人体后主要侵犯小肠远端和结肠、肾脏、肺、脾脏和大脑。引起肠粘膜水肿、出血、液体蓄积、肠细胞水肿、坏死及肾脏、脾脏与大脑的病变。在大肠杆菌O157:H7感染的病例中，5~10%的感染患者会发展为溶血性尿毒症综合症，这种疾病会破坏血细胞并最终导致肾衰竭。与一般的大肠杆菌菌株相比，大肠杆菌O157∶H7不含有一般肠毒素基因密码，但可产生毒力更强的志贺样毒素，引起高烧等中毒症状。 

单核增生李斯特菌也是是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李斯特菌病，感染后主要表现为败血症，此外，也会引起脑膜炎、脑炎、心内膜炎、流产、脓肿和局部的脓性损伤等疾病，单核增生李斯特菌主要感染免疫低下的个体，包括孕妇、新生儿、免疫力低下人群及老年人，并且其死亡率可高达30%，其致病性物质主要是杆菌素(monocins)和菌株表面成分。单核增生李斯特菌在4℃的环境下仍可生长繁殖，是冷藏食品食品安全一项重要隐患。 

现存的检测这3种致病菌的方法主要是通过传统的培养方法，具有时间周期长，操作复杂等缺点，而且大部分是分别进行检测，效率较低。目前也出现了采用多重PCR技术进行的同时检测，但往往只是两种致病菌的同时检测，而当对更多菌种进行同时检测时，则容易出现特异性不强，准确度较低等问题，此外由于多重PCR的影响因素相当复杂，模板、引物、反应体系以及循环参数等等都会对最终的检测结果起到很大的影响，并且同时限制了对目的基因的选择，因此多重PCR在对多个菌种进行同时检测时，在目的基因的选择以及引物设计等方面都存在很多困难。 

作为人类最常见的三大致病菌感染源，有对于鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和单核增生李斯特菌的更高效、更快速、更准确并且可以同时进行的 检测方法的需要。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、快速、特异性强、灵敏度高的能同时检测活鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌的方法。该方法可用于食品样本中活鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌的初筛检测，其操作简便、结果客观准确，避免了现有方法操作繁琐、费时费力、成本高昂的缺点。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

在第一方面，本发明提供了一种采用连接多克隆抗体的磁珠收集目标菌、叠氮溴化丙锭（PMA）处理和多重PCR相结合的同时检测鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和单核增生李斯特菌的方法。 

本发明的方法可包含下列步骤： 

（1）任选地，制备鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌的多克隆抗体并纯化； 

（2）将纯化的鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌的多克隆抗体与表面羧基化的纳米磁珠偶联，将所述偶联的免疫磁珠与检测样本接触，收集目标菌，并将磁珠分离，洗脱，收集洗脱液； 

（3）用PMA处理所述洗脱液，离心，收集菌体沉淀并提取DNA；和