[发明专利]一种高效快速分离人间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种脐带胶质间充质干细胞的制备方法，其主要制备工艺包括：利用35岁以下健康足月妊娠产妇剖宫产后的新鲜脐带组织，0.9％无菌生理盐水中浸泡，5小时内，冰块上运输至无菌操作室。用0.9％无菌生理盐水清洗脐带组织上的血液和血凝块，利用无菌缝合线将三通管固定在脐静脉和脐动脉内，0.9％生理盐水大量冲洗血管腔以完全去除血液，本操作可最大程度的发挥消化酶的活性，提高间充质干细胞的获得率。将脐带组织剪成5mm³左右的小块，Librase Blenzyme37摄氏度滚动摇床上消化1小时，收集细胞悬液，用含血清的培养基终止消化酶的作用，100目过滤网过滤后收集细胞用0.9％无菌盐水清洗细胞2次，用含体积分数10％胎牛血清或体积分数20％人AB型血清的细胞完全培养基重悬细胞，37度，5％CO²培养箱中培养；另外消化后剩余的组织块用0.9％无菌盐水清洗两次后，放入完全培养基中，37度，5％CO²培养箱中培养。本发明优化了干细胞提取的操作过程，无干细胞的数量损失。24到48小时后，更换培养基。以后隔日换液，细胞增殖到80％融合时，传代培养。细胞可新鲜使用或冻存。

2.根据权利要求1的脐带胶质间充质干细胞的制备方法，脐带运输方法；具体为35岁以下健康足月妊娠产妇剖宫产后的新鲜脐带组织，0.9％无菌生理盐水中浸泡，5小时内，冰块上运输至无菌操作室。

3.根据权利要求1的脐带胶质间充质干细胞的制备方法，将三通管固定在脐静脉和脐动脉内，0.9％生理盐水大量冲洗血管腔以完全去除血液，本操作可最大程度的发挥消化酶的活性，提高间充质干细胞的获得率。

4.根据权利要求1的脐带胶质间充质干细胞的制备方法，Librase Blenzyme 37摄氏度滚动摇床上消化1小时，收集细胞悬液，5％胎牛血清的低糖DMEM培养基终止消化酶的作用，其特点为联合酶37摄氏度滚动摇床上消化时间为1小时。

5.根据权利要求1的脐带胶质间充质干细胞的培养方法，使用的培养基含10-20％体积分数胎牛血清可替换为10-20％体积分数AB型人血清或AB型脐带血血清。

6.根据权利要求1的脐带胶质间充质干细胞的制备方法，特点为使用的培养基为含有25mmol/LGlutamax替代谷氨酰胺(Glutamine)。

7.根据权利要求1-6所述的方法制备的脐带胶质间充质干细胞，具有以下技术特征：

a.在培养皿中贴壁生长，呈梭状生长增殖，细胞形态清楚，细胞浆内清澈，细胞核清晰。

b.细胞表面抗原表达符合国际细胞治疗协会的标准：阳性表达的抗原：CD73；CD90；CD105，阳性率达到95％以上。低表达造血干细胞标志抗原CD34、血细胞抗原CD45和组织相容性抗原HLA-DR，表达阳性率低于1％。

c.扩增后的间充质干细胞具有分化成骨细胞、脂肪细胞的多向分化能力。