[发明专利]一种高效快速分离人间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明是一种快速高效的提取和培养脐带间充质干细胞的生物技术发明。本发明的特点为联合应用酶消化法和组织贴壁法，优化了干细胞提取的操作过程，无干细胞的数量损失，培养扩增后的间充质干细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的多项分化能力。 

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的多能干细胞。MSCs广泛存在于多种组织中，迄今已经从骨髓、脐带血、脂肪组织、外周血、皮肤等组织中提取出MSCs. 

MSCs具有强大的多方向分化功能。在适合的分化条件下MSCs可以分化成软骨细胞，脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞，神经细胞，平滑肌，骨骼肌细胞等。世界范围的临床前实验结果表明，MSCs对于心肌缺血性疾病、糖尿病、帕金森综合征、难治性骨折、脊柱损伤等疾病均有显著疗效。MSCs还具有免疫抑制作用，能够诱导机体免疫耐受，在体内外通过抑制T细胞、B细胞和NK细胞的活化和增殖，从而诱导免疫耐受。MSCs联合造血干细胞输入可有效缩短重建造血系统的时间，患者的恢复状况较好。MSCs因为其强大的治疗潜力而成为细胞治疗的理想种子细胞。 

但间充质干细胞在骨髓、外周血、以及成年组织中的含量均较少(1X10⁷细胞中1个)，虽然MSCs具有较强的体外扩增能力，并且在体外长期培养中仍保持多方向分化潜能和生物活性，其来源组织MSCs的获得量，扩增能力仍是决定MSCs治疗效果的重要因素。 

脐带组织为新生组织，较成年人的骨髓、外周血中的MSCs的生物活性相对较高，近来脐带组织以其易获得性、所含的MSCs活性较好，不涉及伦理问题等特点而成为MSCs的较理想组织来源。 

从脐带组织提取MSCs技术方法不尽相同，主要利用流式细胞仪分选法、磁珠分选法、酶消化法或贴块法获取贴壁细胞，并利用MSCs的粘附特性，利用多次消化传代方法去除其他的细胞种类，从而在较长的时间后获得大量的MSCs。前两种方法因为操作复杂、费用较高而很难得到普及应用。而且MSCs缺乏特异性表面抗原也局限了这两种方法的普及应用。酶消化法或贴块法操作简单易行，但获得的细胞数量因使用的消化酶不同、组织块内部细胞无法贴壁生长而造成了细胞数量的大量丢失。为获得较大量的细胞，原有的方法多通过延长胶原酶的消化时间的方法，大多采用6小时酶消化时间(参考专利号201010605542.3)。但是延长消化时间会对细胞的增殖活性和分化潜能造成较大的负面影响。 

[0005]本发明首先优化了Liberase Blenzyme酶消化法的配方和消化和时间，将细胞消化时间缩短为1小时，不仅减少了长时间消化对细胞活性的影响，细胞获得数量较常规方法也明显提高。

[0006]本发明联合利用分离酶消化法后，将消化后松散的组织块贴壁培养，最大限度的减少了细胞的丢失，而且组织块在经过酶消化后变的结构比较松散，贴壁的面积变大，剩余的MSCs全部回收利用，无细胞量的损失。

本方法提取的MSCs在经过体外培养扩增后的仍具有较高的分化潜能。本发明是一种高效快速获得MSCs的生物技术发明，将为MSCs临床治疗提供充足可靠的细胞来源，具有较高的应用价值。 

发明内容

本发明的目的之一是通过联合应用分离酶(Liberase Blenzyme)消化法缩短了酶消化时间，增加了干细胞的数量并更好的保持了细胞的生物活性，优化了干细胞提取的操作过程。 

在酶消化前，利用大量的0.9％生理盐水冲洗脐血管内的血液，避免了消化酶的活性被血液所中和。 

本发明的另一目的是优化了MSCs的体外扩增培养条件，能在较短的时间内获得大量的高生物活性的脐带间充质干细胞。从第3代到第10代的细胞向脂肪细胞和成骨细胞分化的活性未发生改变。 

既往专利号为201010125235.5的专利宣称他们的方法细胞倍增时间约为36小时，每传一代细胞数目增长2倍。本发明利用Glutamax代替Glutamine使MSCs的体外倍增时间所短为24小时，采用优化的密度种植使每传一代细胞数目增长10倍。改善了MSCs在体外的增殖能力。综上所述，本发明有效的缩短了酶消化时间，减少了对细胞活性的影响，联合应用分离酶消化法和组织块贴壁法，最大限度的减少了细胞数量的损失。优化的培养条件使干细胞的体外增殖能力增强并保持高分化能力直至第10代。本发明将为干细胞的临床应用和科研提供成充足的、高活性的细胞来源，具有较高的实用价值。