[发明专利]一种精制谷胱甘肽发酵液的方法

说明书

技术领域

本发明涉及谷胱甘肽的分离纯化，特别是涉及用制备型液相色谱精制谷胱甘肽发酵液的方法，属于分离纯化技术领域。

背景技术

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，即γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酰甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成具有重要生理功能的活性三肽。它主要以还原态(GSH)和氧化态(GSSH)两种形态存在，其中在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽。GSH在临床、保健产业、食品、饲料等领域有着极其广泛的应用。随着近年来人们对保健养生的逐渐重视，GSH的需求量逐年上升。目前，谷胱甘肽的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、酶法和发酵法。其中发酵法是最具潜力的方法，已经成为国内外生产GSH最普遍的方法。国内采用发酵法生产谷胱甘肽的瓶颈主要在于发酵水平低下，后续提纯工艺收率低，产品纯度低、质量差、成本高，远达不到医药级GSH的质量要求。

色谱是迄今为止人类掌握的对复杂混合物分离效率最高的一种方法。当混合物中各组分的化学或物理性质十分接近时，用其它分离技术很难使其分离，此时色谱技术就能显示出其实际有效的优越性。经典柱色谱法虽然可以处理大量样品，但效率低下，分离周期长，溶剂消耗量大。而现代制备色谱法则具有柱效高，分离速度快等特点，是分离纯化天然产物与化学合成产物的极好技术手段。制备色谱研究的核心，是色谱过程的放大。尽管制备色谱的模型与分析色谱的模型相似，但是制备色谱并非分析色谱简单的放大，二者有着许多的不同。分析色谱是在最短时间内得到最大的分离效率，并且需要全面的反应样品组成信息，不必收集特定组分，洗脱液直接弃掉；制备色谱则是在保持最低分辨率的前提下，使柱子超载以获得最大物料通过量，需对其洗脱液进行收集，从而可以在最短时间内得到更多的纯组分，其主要考虑因素是目标产物的纯度、产量、周期、运行成本等。

制备型液相色谱属于非线型色谱，利用制备型液相色谱可以获得一定纯度的产品。与分析型液相色谱相比，制备型液相色谱的进样量远大于分析型液相色谱，其色谱峰峰型不对称，且峰的保留时间随样品量的大小变化而变化，色谱峰的高度与样品量的大小不呈正比例关系。与其他制备方法相比，液相色谱是目前技术最成熟、应用最广泛的一种。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的不足，利用制备型液相色谱，提供一种对谷胱甘肽粗品进行精制的方法，使谷胱甘肽粗品中GSH纯度从45％～55％提高到85％以上。

本发明用的制备型液相色谱法，是一种基于组分在柱填料和洗脱液中分配系数的差异，当两者作相对运动时，样品中的不同组分将会形成不同迁移速度的谱带而实现分离的新型高效分离技术。该法已经广泛的用于各种高纯度生物活性物质的制备，适合对谷胱甘肽粗品的精制。

为达到精制谷胱甘肽的目的，本发明采取的技术方案为：

一种利用制备型液相色谱精制谷胱甘肽发酵液的方法，包括以下步骤：

(1)样品的预处理：对发酵菌种经过破壁处理得到的谷胱甘肽抽提液进行离心，并对离心液进行超滤处理，以除去其中的大颗粒杂质。再用大孔吸附树脂对其初步纯化处理得预洗脱液，收集并浓缩预洗脱液得到谷胱甘肽粗品；

(2)调节粗品pH：用0.1mol/L的盐酸溶液调节步骤(1)所得的谷胱甘肽粗品的pH值为3.0～3.5；

(3)参数设置和进样：设置制备液相色谱的操作参数，扫描波长为210±10nm，扫描时间为60±5min，同时对流动相流速及流动相组分进行设定，基线水平后进样，经制备型液相色谱分离后得洗脱液；

(4)收集洗脱液：当响应值大于100mAU后开始收集流出液，并对每个响应峰分别收集。用亚硝基铁氰化钾法对收集液进行定性判断，收集谷胱甘肽高峰液，以质量分数计，纯度在85％以上。

进一步地，经过预处理后得到的谷胱甘肽样品浓度优选为5g/L-10g/L。

以质量百分比计，经过预处理后得到的谷胱甘肽样品纯度为45％～55％。

步骤(3)中，所用的流动相优选甲醇溶液，其浓度为5％～10％。

步骤(3)中，所用流动相流速为3mL/min～5mL/min。

步骤(4)中，收集谷胱甘肽高峰液区域为13min～20min。

相对于现有技术，本发明精制谷胱甘肽粗品的方法具有以下有益效果：

(1)本发明所用制备型液相色谱具有较高的分离效率，处理量大，能实现自动化操作等优点。