[发明专利]生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板及其制备方法

权利要求书

1.一种生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板，包括聚苯乙烯微孔板，其特征在于：聚苯乙烯微孔板的每个微孔内预先包被有1.5-3.0微克生物素标记的牛丙种球蛋白、2.7-3.3微克链霉亲和素，并用封闭溶液封闭。

2.根据权利要求1所述的酶标板，其特征在于：每个微孔内预先包被有2.25微克生物素标记的牛丙种球蛋白、3.0微克链霉亲和素，并用250微升封闭溶液封闭；优选的，所述封闭溶液由如下组分制得：

NaH₂PO₄2H₂O     0.29g

Na₂HPO₄12H₂O    2.9g

ACA             2g

NaCl            8.76g

ddH₂O900ml，调pH＝7.3-7.5

牛血清白蛋白    4.0g

蔗糖            35g

Procilin 300    0.5ml

加ddH₂O定溶至1000ml。

3.根据权利要求1或2所述的酶标板，其特征在于：所述聚苯乙烯微孔板为96孔聚苯乙烯微孔板。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述酶标板的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备生物素标记的牛丙种球蛋白溶液；

(2)制备酶标板：

1)在聚苯乙烯微孔板的每个微孔中加入150微升，经缓冲液-I稀释至10-20微克/毫升的生物素标记的牛丙种球蛋白溶液，将微孔板放在密封的容器内，室温下放置16-18小时；

2)甩净微孔内溶液，并拍干；用缓冲液-I洗涤微孔板2次，每次每孔加300微升缓冲液-I，静置20秒，吸干；

3)甩净微孔内溶液，并拍干；

4)每个微孔中再加入150微升，经缓冲液-II稀释至18-22微克/毫升的链霉亲和素溶液，将微孔板放在密封的容器内，室温下放置2小时；

5)甩净微孔内溶液，并拍干；用缓冲液-II洗涤微孔板2次，每次每孔加300微升缓冲液-II，静置20秒，吸干；

6)每个微孔中再加入封闭溶液250微升，将微孔板放在密封的容器内，4℃，放置过夜；

7)重复步骤3)；

8)将经步骤7)得到的聚苯乙烯微孔板真空干燥至少6小时，得所述的酶标板；

所述缓冲液-I由如下组分制得：

ddH₂O     900ml

Tris      6.05g

NaCl      8.77g

调pH＝8.0，加0.5ml Procilin 300，再加ddH₂O定容至1000ml；

所述缓冲液-II由如下组分制得：

ddH₂O           900ml

NaH₂PO₄.2H₂O    4.68g

Na₂HPO₄.12H₂O   7.16g

NaCl            8.77g

L-Tryptophan    0.2g

调pH＝8.0，加ddH₂O定容至1000ml。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述生物素标记的牛丙种球蛋白溶液由如下方法制备得到：

(1)用0.1M，pH 9.5的碳酸盐缓冲液溶解牛丙种球蛋白，并稀释至0.5-1.0 mg/ml；

(2)将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与牛丙种球蛋白的摩尔比为(20-10)∶1比例将二者混合，并在室温下搅拌反应3-6小时，优选4小时；

(3)将经步骤(2)反应后的液体用0.01M，pH 7.4磷酸盐缓冲盐水于4℃透析24小时，去除游离生物素；

(4)用紫外吸收测定经步骤(3)标记好生物素标记的牛丙种球蛋白溶液蛋白含量。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：按照生物素与牛丙种球蛋白的摩尔比18∶1比例将二者混合。