[发明专利]生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于酶免疫分析技术，具体涉及一种生物素化牛丙种球蛋白-链霉亲和素酶标板及其制备方法。

背景技术

标记免疫分析是一种免疫分析与示踪(标记)技术相结合的分析技术。抗原(antigen，Ag)和相应抗体(antibody，Ab)之间存在空间结构的互补关系，两种分子相遇时会发生特异性结合形成抗原抗体复合物(AgAb)；示踪技术是将高灵敏性物质(放射性同位素、发光剂等)标记在抗原或抗体分子上形成标记抗原(Ag^*)或标记抗体(Ab^*)；这样，可以通过测定示踪物质(标记物)便可以检测Ag^*(Ab^*)或复合物Ag^*Ab(AgAb^*)。抗原抗体反应具有高度特异性，示踪技术具有高敏感性，二者的完美结合赋予标记免疫分析高敏感性和高特异性，并广泛应用于生物和医学领域中超微量物质的检测。

在标记免疫分析技术中，如示踪物质的特性不会因结合抗原(抗体)而发生改变，且在反应体系中，标记抗原(抗体)往往是过量的，抗原抗体反应结束后，仍然会存在剩余的、未结合的标记抗原(抗体)，称之为游离标记物。此时，测定前必须分离结合状态标记物(Ag^*Ab)和游离状态标记物(Ag^*)，通常测定结合状态标记物(Ag^*Ab)才能反映抗原抗体反应的强度。如在测定前需要分离结合状态标记物和游离状态标记物，一般称为非均相免疫分析。非均相免疫分析通常采用固相吸附法去除游离标记物(Ag^*)。固相吸附分离法是将抗原(抗体)吸附在固相载体表面，使免疫反应在固相载体表面上进行，待测物质(抗体或抗原)、标记抗体(抗原)均可通过免疫反应结合在固相材料表面，未结合物质(含游离标记物)存在于液相中。此时，弃去液相并经洗涤，便可去除游离标记物。

酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是常用的标记免疫技术之一，以酶作为标记物，采用固相吸附分离模式。以双抗体夹心反应模式为例，测定原理如下：应用聚苯乙烯(96孔酶标板)作为固相材料，通过非特异性吸附方式连接特异性抗体(也称捕获抗体)，此过程称为包被。加入待检标本，如标本中含有相应抗原，必将被特异性抗体捕获，于固相材料表面形成免疫复合物，未结合物质游离于液相中，通过洗涤方式即可去除。此时在加上酶标记抗体(也称指示抗体)，酶标抗体与待检抗原结合，形成捕获抗体-待检抗原-标记抗体复合物，过剩的标记抗体(游离标记物)存在于液相中，倾倒液体，并洗涤即可去除游离标记物。最终加入显色底物，酶催化底物显色，通过测定吸光度值反映抗原抗体反应强度(待测抗原含量)。

将捕获抗体吸附在固相材料表面，并保留原有生物活性不变，此过程称为包被(或制备酶标板)。目前，抗体包被仍采用非特异性吸附技术：将捕获抗体用包被缓冲液(磷酸盐或碳酸盐)稀释至一定浓度，加入96孔微量反应板内。由于聚苯乙烯具有吸附蛋白特性，能够吸附抗原或抗体，经过一段时间温育后，抗原或抗体即被固定于固相材料标本，同时保留原有生物活性。由于包被液中蛋白浓度很低，抗体或抗原分子不能完全覆盖所有结合位点。为防止后续反应时发生非特异性吸附，需在加入高浓度牛血清白蛋白(BSA)(1％～2％)进行封闭空白位点。酶标板经真空干燥、真空包装即可。

上述传统包被技术具有流程简单、操作方便等优点，并被广泛应用。但是，此种将抗体分子直接吸附于固相材料表面，特别是96孔微量反应板(微孔内壁)存在以下缺陷，这些缺陷严重影响酶联免疫技术的检测性能。

(1)抗体固相化影响原有生物活性

捕获抗体与固相材料结合，导致抗体空间分子构象不同于液相。抗原抗体反应依赖于空间构象，抗体固相化所导致的构象变化必然会影响抗体的利用效率，不利于抗原抗体结合。

(2)微孔内壁有限面积限制抗体包被量

由于微孔内壁的表面积有限，包被的抗体分子数量有限，加上固相化导致利用率的降低，导致有效抗体分子数量不能满足检测体系的要求，由此会缩小检测范围，影响检测效果。

(3)抗体固相化影响与抗原反应的速率

由于固相表面抗体分子处于静止状态，界面反应动力学显示固相抗体分子与液相中抗原相碰撞几率远小于液相反应。由此，抗体固相化必然会增加抗原抗体反应达到平衡所需的时间。

发明内容