[发明专利]一种新德里金属β内酰胺酶1核酸适体及其筛选方法和应用

权利要求书

1.一种新德里金属β内酰胺酶1(NDM-1)核酸适体，其特征在于：所述核酸适体为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

2.一种如权利要求1所述的核酸适体的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

1) NDM-1的预处理

将NDM-1用包被缓冲液稀释至5μg/ml，向96孔酶标板的8个孔中分别加入120μl NDM-1溶液，4℃包被过夜，然后用150μl 选择缓冲液37℃封闭1h；

2)随机单链DNA文库的预处理

将随机单链DNA文库于95℃变性5mi后立即置于冰中10min，然后用选择缓冲液稀释至1ml，并于25℃ 温育30min；

3) 随机单链DNA文库中单链DNA与NDM-1的结合

将步骤2）预处理后的随机单链DNA文库加入至包被有BSA-CL的酶标板中，37℃条件下在湿盒中静置1h后，弃孔中的液体，然后每孔加入1×选择缓冲液200μl，连续震荡洗涤1min，用于去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链DNA，如此重复5次；最后一次洗涤后，向每孔中加入100μl 单链DNA洗涤缓冲液，80℃加热10min，再用酚：氯仿：异戊醇的比例为25:24:1制成的混合溶剂抽提一次，取上清，加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，最后定容至80μl，获得单链DNA 溶液；

4) 单链DNA的扩增

以步骤3)获得的单链DNA 溶液为模板进行PCR扩增，获得双链DNA；

5) 用于下一轮筛选的单链DNA的制备

将步骤4)获得的双链DNA用纯化试剂盒纯化，然后用链亲和素磁珠从双链DNA中分离单链DNA，投入到下一轮筛选；

6）反向筛选

由于使用了BSA进行包被，为了除去随机单链DNA文库中可能存在的与BSA结合的核酸适体，在每两轮正向筛选之间，进行一次反向筛选：

将经过某一轮筛选后获得的单链DNA加入到用BSA包被和封闭的酶标板孔中，于37℃温育45min，使BSA与核酸适体充分结合，然后，取上清，用于下一轮筛选；

7) 克隆及测序

经过10轮筛选后获得目的寡核苷酸序列，克隆测序所述目的寡核苷酸序列，最终获得核酸适体。

3.根据权利要求2所述的核酸适体的筛选方法，其特征在于：步骤1)中，所述包被缓冲液为pH9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液。

4.根据权利要求2所述的核酸适体的筛选方法，其特征在于：步骤2)和步骤3)中，所述选择缓冲液为pH 7.4的50 mmol/L Tris-HCl含1% BSA , 0.01%鲑鱼精DNA、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl₂、5 mmol/L KCl和0.05% Tween 20配制而成的溶液。

5.根据权利要求2所述的核酸适体的筛选方法，其特征在于：所述步骤b中，所述洗涤缓冲液为pH 7.4的50 mmol/L Tris-HCl含0.05%（V/V）Tween 20配制而成的溶液。

6.一种如权利要求1所述的核酸适体的应用，其特征在于：用于NDM-1的检测。

7.一种如权利要求1所述的核酸适体的应用，其特征在于：用于制备NDM-1的检测试剂。