[发明专利]一种新德里金属β内酰胺酶1核酸适体及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能够与新德里金属β内酰胺酶1高亲和力和高特异性结合的核酸适体及其筛选方法和应用。 

背景技术

金属β内酰胺酶（metallo β-lactamases，简称MBLs）具有稳定且高效的碳青霉烯类（丝氨酸酶不能将其水解）的水解活性，可以催化水解除了单环外几乎所有的β-内酰胺类抗生素，而且MBLs不能被临床上的现有的MBLs抑制剂所抑制。目前，MBLs已经在多种临床革兰阴性菌株中分离出，另外，在炭疽杆菌中也发现编码MBLs的沉默基因。 

2010年，印度、巴基斯坦等南亚国家出现了一种新型细菌变种基因，拥用这种基因的细菌对包括头孢类、碳青霉烯类、氨基糖苷类等绝大部分抗生素都有耐药性，科学家将这种超级耐药基因命名为新德里金属β内酰胺酶1 (New Delhi metallo-β-lactamase-1，简称NDM-1)基因，NDM-1是NDM-1基因所编码的产物酶。拥有NDM-1基因的超级细菌对几乎所有类型的抗生素都有耐药性，其患者将面临无药可救的境地。这为我们滥用抗生素敲响警钟的同时，也为耐药性及相关新抗研究提出了挑战。 

中国大陆已有从鲍曼不动杆菌中检出NDM-1的报道。2010年10月26日，中国疾病预防控制中心通报，检出2 株产NDM-1 的屎肠球菌，该菌株分离自宁夏某县医院的2 例新生儿粪便标本。由于NDM-1多位于质粒、整合子等可移动元件上，易于广泛转移和传播，因此，加强NDM-1细菌的监测非常重要，对临床治疗亦十分有利，临床医师可以直接选择较敏感的化疗药物如单环类抗生素治疗，而且对患者而言，也可节约住院时间和费用。 

目前，对于金属β内酰胺酶的检测，临床上普遍采用基于细菌培养的方法进行检测，然而，这种检测方法不仅费时，而且容易出现假阳性或假阴性。为此，中国于2011年颁布《产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌感染诊疗指南（试行版）》，指南中推荐NDM-1细菌的实验室诊断包括表型筛查、表型确认和基因确证三个步骤。其中，表型筛查是以美罗培南或亚胺培南纸片法（K-B法）或最低抑菌浓度（MIC）测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查，达标准者再用双纸片协同试验进行表型确认，最终采用NDM-1基因特异引物进行PCR 扩增及产物测序，确定菌株是否携带NDM-1基因。然而，表型筛查和表型确认均采用传统的药物敏感性测定方法，耗时较长，容易导致病情的延误。 

核酸适体是能够特异结合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸片段（单链DNA或单链RNA），它具有高特异性和亲和力识别其靶标分子，一些与疾病密切相关的生长因子、酶、受体等物质均能成为核酸适体的靶标。因此，亟需要研究和发展能够与NDM-1特异性结合的核酸适体，为NDM-1基于核酸适体的临床快速诊断技术打下基础，从而能够快速地检测出NDM-1细菌，使病情得到及时、有效地治疗。 

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术中的不足之处而提供一种易于制备、节约成本、能够与NDM-1高亲和力和高特异性结合的核酸适体，从而为NDM-1基于核酸适体的临床快速诊断技术打下基础。 

本发明的目的之二在于克服现有技术中的不足之处，提供一种易于制备、节约成本的、能够与NDM-1高亲和力和高特异性结合的核酸适体的筛选方法。 

本发明的目的之三在于提供一种上述核酸适体在NDM-1的检测中的应用。 

本发明的目的之四在于提供一种上述核酸适体在制备NDM-1的检测试剂中的应用。 

本发明的目的由以下技术措施实现： 

提供一种新德里金属β内酰胺酶1核酸适体，所述核酸适体为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

本发明还提供一种上述核酸适体的筛选方法，包括以下步骤： 

1) NDM-1的预处理

将NDM-1用包被缓冲液稀释至5μg/ml，向96孔酶标板的8个孔中分别加入120μl NDM-1溶液，4℃包被过夜，然后用150μl 选择缓冲液37℃封闭1h；

2) 随机单链DNA文库的预处理

将随机单链DNA文库于95℃变性5mi后立即置于冰中10min，然后用选择缓冲液稀释至1ml，并于25℃ 温育30min；

3) 随机单链DNA文库中单链DNA与NDM-1的结合