[发明专利]牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明利用碱性蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备抗氧化肽，属于生物技术领域。

背景技术

人体自由基的来源有两种，一是生物在氧化反应或其伴随的次反应中产生，二是空气污染、食物中的脂肪腐败、吸烟和紫外线作用与生物体产生。生物有自身的清除自由基防御系统。但自身的防御系统不足以清除自由基时，自由基会造成DNA损伤、细胞膜磷脂过氧化和低密度脂蛋白的改变，启动慢性疾病的发生。目前认为有70多种病与自由基有关，包括心脏病、动脉硬化、静脉炎、关节炎、过敏、白内障、老年痴呆、冠心病及癌症。

人们需要抗氧化剂去抵抗氧化应激反应，合成的抗氧化剂虽然高效、廉价，但由于有副作用，人们更青睐于选择天然的抗氧化剂。食物来源的抗氧化剂很多，人们从植物和动物源的蛋白中都获得了抗氧化肽。其中包括：花生、米糠、玉米、苜蓿、山药、豆奶、鱼类、蛋黄蛋白、酪蛋白等。

牦牛乳酪蛋白是以西北特有的资源曲拉为原料，通过提取纯化制备的蛋白质，是无限量添加的食品添加剂和营养强化剂。由于酪蛋白疏水性氨基酸含量高，蛋白质含量在90%以上，牦牛乳酪蛋白不易溶于水，溶于弱碱液。

活性肽是包含在完成蛋白质结构中的特定序列，只有通过水解后，才能释放出各种生理功能，这些肽主要含2～20个氨基酸残基，分子量小于6000Da。表现出阿片肽、矿物质吸收、免疫调节、抗微生物、抗血栓、降血脂、抗氧化、降血压等特性。

抗氧化肽的活性主要和肽的结构、组成和疏水性有关。其中酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、胱氨酸和组氨酸的存在对抗氧化肽的活性影响最大。除此外氨基酸在肽中的位置、蛋白的种类、水解酶的种类、肽的分子量和肽的含量都对抗氧化活性有影响。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法。用碱性蛋白酶水解酪蛋白制备抗氧化肽，实现了牦牛乳酪蛋白的深加工，缓解食物源抗氧化肽市场供应不足的问题，工艺简单，抗氧化活性高，适合工业化推广生产。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：

（1）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白20g～40g，加水500mL，调节反应温度30℃～60℃，pH7.0～9.0，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；所述的牦牛乳酪蛋白购自华羚酪蛋白股份有限公司

（2）加碱性蛋白酶水解：吸取250μL～500μL酶液，维持反应温度30℃～60℃，pH7.0～9.0，反应1～4小时；碱性蛋白酶购自诺维信，产品名称Alcalase2.4L FG；

（3）灭活碱性蛋白酶，升温至80℃～100℃，维持15～30分钟；

（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.1～4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；

（5）离心：4000g～10000g离心力，离心5～30分钟，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；

（6）超滤：取离心后上清液，过截留量6000Da的超滤膜，收集透过液，除去大分子蛋白及多肽；

（7）喷雾干燥：取步骤（6）中的超滤透过液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。

还包括有：在步骤（6）超滤后还包括有纳滤步骤：取超滤透过液，通过截留分子量为200Da的纳滤膜，收集回流液，除去小分子盐和氨基酸；然后进行喷雾干燥步骤：取纳滤回流液，采用喷雾干燥机进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗氧化肽。

所述的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的制备方法，所述的牦牛乳酪蛋白为食品级牦牛乳酪蛋白；所述的碱性蛋白酶为食品级碱性蛋白酶；所述的盐酸为食用级盐酸。

所选用的酶制剂为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶其中的一种。

对以上方法得到的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽进行抗氧化活性测定：

DPPH(1,1～二苯基～2～苦基苯肼)自由基清除测定方法：其操作步骤如下：

①分别吸取1mL待测液（10mg/mL）和1mL DPPH的无水乙醇溶液（1×10^～4mol/L）置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Ai；

②分别吸取1mL待测液（10mg/mL）和乙醇溶液置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Aj；

③分别吸取DPPH和乙醇溶液置于试管中，摇匀，在暗处反应30min后在波长517nm处测吸光度值Ac。结果计算：

羟自由基清除测定方法：其操作步骤如下

①试剂配制：