[发明专利]一种富集液态乳中β-内酰胺类青霉素抗生素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学中样品前处理领域，具体是涉及一种以苯胺功能团的超顺磁纳米或亚微米磁球富集液态乳中青霉素抗生素的磁分散固相萃取方法。

背景技术

牛奶是大自然赐予人类最理想的天然食品，奶业及其由奶业衍生的乳制品行业的健康发展是衡量一个国家现代农业发展水平的重要标志之一。目前我国乳品行业正进入前所未有的高速发展期，乳制品的质量与安全问题日益受到人们的关注，其中严重滞后的产品质量检测监控手段，为乳业食品安全留下了诸多隐患，如2004年下半年发生的阜阳劣质奶粉事件，2008年9月曝光的“三聚氰胺”奶粉事件以及一直困恼液态奶健康发展的抗生素残留问题等。青霉素类抗生素是一类含有β-内酰胺基母核结构的抗生素总称，是当前医药和兽药行业治疗和预防因葡萄球菌、 肺炎球菌、链球菌、 大肠杆菌、沙门氏菌引起的动物尿道、 胃肠道和呼吸道以及乳房炎感染应用最多的一类抗生素。中国、日本、欧盟、 美国、国际食品法典委员会都已经对液态乳制品中青霉素类药物残留规定了最大残留限量值。由于青霉素类抗生素良好的抗菌效果，仍广泛地应用于动物饲养，尤其是奶业养殖中。乳房炎疾病是奶业养殖中最为常见的疾病之一，而青霉素类抗生素是最为有效地治疗药物之一, 如果使用者使用不当或不遵守休药期规定 , 均可能造成此类抗生素在分泌的液态奶中残留量超出国家限量标准 , 从而给人类健康带来潜在的危害。

建立有效、合理、快速和经济的检测技术是解决奶业生产、流通及消费过程中食品安全评价、预警及监控体系的有效技术支撑。目前用于青霉素类抗生素残留检测的常用方法包括微生物培养法、免疫学检测方法（ELISA）以及仪器分析法等。微生物培养法是利用青霉素类抗生素能抑制微生物生长原理的基础上建立起来的简便测定方法，但由于液态乳中存在的抑菌物质较多，因此测定的结果往往容易存在假阳性，且检测灵敏度偏低。免疫学检测方法具有分析速度快, 能同时筛选大量样品的优势，但该方法仍存在假阳性高、 不能同时对多残留组分进行分别定量检测的缺陷。同时以上方法仅能用于青霉素类抗生素残留的筛查分析。仪器分析法因具有检测灵敏度高，能同时进行多组分检测，因此仍是液态乳中青霉素类抗生素残留确证分析的最常用手段。

在青霉素类抗生素残留仪器分析方法中，样品前处理过程往往是最耗时，耗力的环节。在国标（农业部781号公告）-牛奶中青霉素类药物残留检测方法-高效液相色谱法中规定了牛奶中样品前处理流程。具体如下：取5 mL待测乳液，加入溴化四丁基铵乙腈溶液10 mL，摇匀。3000 rpm离心10 min，重复以上抽提步骤2次，合并上清液。加入10 mL正己烷，摇匀后静置10 min，除正己烷层，在45-50℃旋转蒸发至3-4 mL，过C₁₈固相萃取柱净化处理。最后采用3 mL乙腈洗脱，洗脱液氮气吹干后进行衍生化处理。叶能胜等在“固相萃取--高效液相色谱法检测牛奶和猪肉中5种青霉素类抗生素”一文中描述采用乙腈提取牛奶中青霉素类抗生素的相对简便方法，具体流程如下：2. 5 mL牛奶试样加入10 mL乙腈, 振荡混合1 min , 离心 15 min (4000 rpm)。取上层清液, 离心后的沉淀物再加入2 mL乙腈重复提取一次。合并上层清液, 40℃下用氮气吹至0. 5～1. 0 mL , 加水10 mL 振荡混匀, 然后过Waters Oasis HLB固相萃取柱提取纯化。常规方法需要过柱、旋蒸等，有工艺复杂，过柱耗时长、易堵塞、流速太快可造成的吸附效率下降，以及装柱时吸附剂填装不均匀密实产生的短路等问题。

发明内容

本发明目的是提供一种更为简便、实效的液态奶中β-内酰胺类抗生素高效富集的新方法。

具体来说本发明的技术方案包含下列步骤：

（1）样品处理：取8-10 mL液态奶，离心至明显分层，取5 mL中间层用于吸附；离心有效地除去液态奶中过多的脂肪以及部分不溶解物。 

（2）吸附：加入5-20 mg苯胺功能团修饰的超顺磁磁球（结构见图1）至液态乳中，混匀吸附3-10分钟，磁力架分离磁球，弃去乳液；吸附后的磁球进一步采用25~50%的甲醇水溶液洗涤。25~50%的甲醇水溶液洗涤其目的旨在进一步除去磁球表面结合的非极性物质，减少液态乳的基质效应对液相色谱的干扰。当然，为了达到更好的效果，也可以多次洗涤。

（3）洗脱收集：加200-500 μL含氨水的乙腈溶液洗脱磁球上的青霉素抗生素，分离磁球，收集洗脱液。