[发明专利]酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用

权利要求书

1.一种酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法，其特征是：以芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵培养得到的芽孢杆菌透明质酸酶对透明质酸或其盐进行降解。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：包括以下步骤：

①配制透明质酸或其盐溶液：向纯化水中加入分子量大于10kDa的透明质酸或其盐，配制成质量体积浓度为1~30%的溶液； 

②酶解：调节步骤①中溶液的温度为20~48℃、pH为4~9，然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶，将透明质酸或其盐酶解至所需分子量，得酶解液；

③灭活：将酶解液在50~90℃下保持10~60min，对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活；

④过滤：向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐，搅拌至完全溶解，然后用孔径为0.45μm的滤膜过滤，得滤液，每100mL酶解液中加入0.1~10g的易溶性无机盐； 

⑤沉淀：向步骤④的滤液中加入滤液体积3~20倍的醇或酮，混合均匀，得到寡聚透明质酸盐沉淀； 

⑥脱水干燥：将步骤⑤中的寡聚透明质酸盐沉淀分离出来，用有机溶剂脱水，然后真空干燥，得寡聚透明质酸盐。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：每1kg透明质酸或其盐配制成的溶液中加入2×10⁷~5×10⁷IU的芽孢杆菌透明质酸酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述芽孢杆菌透明质酸酶的制备方法包括以下步骤：

（1）将芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744菌种进行斜面培养，得斜面菌种；

（2）取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在25~40℃、100~200rpm的条件下培养10~24h，得种子液；

（3）将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，在25~40℃、100~300rpm的条件下培养12~24h，得发酵液；

（4）离心分离发酵液，取上清液，将上清液用硫酸铵分级沉淀出芽孢杆菌透明质酸酶；

（5）将步骤（4）沉淀出来的透明质酸酶溶于磷酸盐缓冲液中，超滤除去小分子杂质，得纯化的芽孢杆菌透明质酸酶；

对芽孢杆菌进行培养时，每100mL斜面培养基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，琼脂粉2.0g，pH调至6.0~8.0；

每100mL种子培养基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，pH调至6.0~8.0；

每100mL发酵培养基中含有以下成分：蛋白胨0.2~2.0g，酵母粉0.2~2.0g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05~0.15g，MgSO₄·7H₂O 0.05~0.15g，葡萄糖0.5~1.5g，Tween80 0.05mL，pH调至6.0~8.0。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：发酵液中芽孢杆菌透明质酸酶的酶活为1×10⁵~3×10⁵IU/mL，纯化后芽孢杆菌透明质酸酶的比活为8×10⁶~1.5×10⁷IU/mg。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征是：步骤①中，透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐；步骤②中，采用酸或碱调节pH至4~9，所述酸为盐酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾；步骤④中，所述易溶性无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐；步骤⑤中，所述醇或酮为乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或异丙醇；步骤⑥中，脱水所用的有机溶剂为酮或醇。