[发明专利]酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶切法制备寡聚透明质酸盐的工艺过程，特别是涉及应用芽孢杆菌来源的透明质酸酶降解透明质酸或其盐制备寡聚透明质酸盐的方法，属于生物技术领域。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为10⁵~10⁷Da（道尔顿）。寡聚透明质酸是指分子量小于10kDa的透明质酸。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，不同分子量的透明质酸甚至表现出截然相反的活性（郭学平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中国生化药物杂志，2003，24（3）：148-150）。

目前，透明质酸降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类，物理降解法很难将透明质酸降至10kDa以下，化学降解法和酶法可以制备寡聚透明质酸，但化学降解法制备寡聚透明质酸，需要较剧烈的反应条件（如较高的酸碱浓度等）才能达到最大程度的降解。此时，不但糖链上的糖苷键断裂，而且单糖（葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖）残基的结构也遭到破坏，如乙酰基被水解掉，单糖六元环断裂等，对制得的寡聚透明质酸的生物活性产生一定影响（郭学平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中国生化药物杂志，2003，24（3）：148-150）。化学降解法制备的寡聚透明质酸还容易发生褐变（专利申请号201110008110.9），生产过程会污染环境。而酶解法降解透明质酸时，只断裂单糖分子间的糖苷键，不会对其他结构造成破坏，而且酶解法反应条件温和，不用强酸强碱，制备的寡聚透明质酸不会发生褐变，不会造成环境污染，因此酶解法最适合制备寡聚透明质酸。

降解透明质酸所用的酶主要是透明质酸酶，根据作用机制的不同，可以分为3类：（1）内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶，为水解酶，作用于β-1,4糖苷键，终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类。（2）水蛭、十二指肠虫来源的透明质酸酶，为内切-β-葡糖苷酸酶，作用于β-1,3 糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性降解透明质酸；（3）细菌透明质酸酶，也称为透明质酸裂解酶（hyaluronate lyase），作用于β-1,4糖苷键，通过β-消去机制得到4,5-不饱和双糖（Kreil, G, Hyaluronidases--a group of neglected enzymes, Protein Sci, 1995, 4(9): 1666-1669）。

目前工业生产寡聚透明质酸或其盐的方法是化学降解法，由于含透明质酸酶的动物组织来源有限，有文献报道的微生物来源透明质酸酶发酵液单位酶活较低，不可能大规模制备透明质酸酶，也就不可能用酶法大规模生产寡聚透明质酸或其盐。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶切法大规模生产寡聚透明质酸盐的方法，本发明采用芽孢杆菌发酵得到的透明质酸酶对高分子量透明质酸或其盐进行降解，酶活高、条件温和、操作简单、无环境污染。 

针对现今生物降解透明质酸或其盐所需降解酶活性低、来源有限、成本高的缺点，发明人从空气中分离得到了一种产透明质酸酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50，该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）进行了保藏，保藏号为CGMCC NO. 5744，保藏时间为2012年2月8日。

该芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO. 5744的获取过程为：将装有富集培养基的平皿打开盖，放置于空气中，收集空气中沉降菌，约1h后，盖上盖，置于25~40℃培养箱中有氧培养，培养24h后，将分离得到的单菌落接种于筛选培养基中，25~40℃，150rpm，有氧培养12~16h，采用中国药典方法测定透明质酸酶活力，选择酶活力最高的菌种作为本发明的菌种，菌种酶活力可达10⁵IU/mL。

上述所采用的各培养基组成如下：