[发明专利]一种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，属于疾病免疫领域。

背景技术

干扰素（Interferon，IFN）是在外源物质（如病原微生物）和肿瘤细胞的作用下，由特定细胞（B细胞、成纤维细胞或上皮细胞）基因控制所分泌的一种糖蛋白。最先是由英国病毒学家Isaacs和瑞士研究人员Linden-mann于1957年在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒的干扰现象时发现的。1963年Lampson等纯化了这种因子，并证明该因子是一种蛋白质，其分子量为20-34kd（鸡干扰素研究进展，家禽科学，2010，(5):46-48）。对干扰素基因序列研究结果表明，该序列早在5-10亿年前就存在于生命细胞的基因序列中，是生物体内一种古老的保护因子。近半个世纪，干扰素一直是病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点，但主要是针对人类及哺乳动物干扰素作用机理及临床实验的研究。

国际细胞因子命名委员会根据干扰素结合受体类型和在染色体上的位置不同，将干扰素分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干扰素。其中Ⅰ型干扰素主要具有抗病毒和抗肿瘤等作用，按其与抗体结合的抗原性不同可分为α、β、τ、ω等。其中IFN-α主要由感染病毒B细胞产生，又可分为13种以上亚型，如IFNα-1、IFNα-2、IFNα-3。亚型又可分为不同的亚亚型，如IFNα-1a、IFNα-1b、IFNα-1c、IFNα-1d以及IFNα-2a、IFNα-2b、IFNα-2c等。IFN-β主要由成纤维细胞和上皮细胞产生，部分来源于巨噬细胞。Ⅰ型干扰素具有耐酸性，在pH2.0~10.0的条件下很稳定。Ⅱ型干扰素又被成为免疫干扰素，只包括IFN-γ，主要由T淋巴细胞和NK细胞产生，具有免疫调节作用，但也有一定的抗病毒活性，但不如Ⅰ型干扰素强。Ⅱ型干扰素既不耐酸，也不耐热，在pH2.0时不稳定，在56℃下30min会被破坏。Ⅲ型干扰素，目前已知的主要包括IFNλ（IL-29）、IFNλ2（IL-28A）和IFNλ3（IL-28B）。Ⅲ型干扰素刺激不同的细胞系后导致的转录应答均与Ⅰ型和Ⅱ型干扰素相似。

Ⅰ型干扰素的产生是天然免疫应答的重要组成部分，是机体抵御外来病原感染的第一道防线。病毒感染后几个小时内，IFN就会出现自分泌和旁分泌效应，从而来抵抗外来病原的感染。Ⅰ型干扰素可以抑制病毒蛋白和DNA的合成，活化NK细胞，促进MHCⅠ类分子的抗原递呈。干扰素的抗病毒活性主要通过PKR途径、2’-5’寡核苷酸合成酶途径、Mx途径和ADAR1途径等来发挥作用，以感染病毒的细胞为靶向，作用于病毒侵染的每个阶段，包括侵入、转录、RNA的合成、翻译起始、成熟、组装和释放，而不是直接作用于病毒本身。

禽类IFN具有以下几种作用：

（1）抗病毒作用IFN并不直接作用于病毒，而是通过诱导正常细胞产生抗病毒蛋白（Antiviral protein，AVP）间接地达到抗病毒的效果，是非特异的，但具有种属特异性。家禽IFNⅠ、Ⅱ型均具有广谱抗病毒作用，Ⅰ型IFN的抗病毒作用最强。首先，IFN与周围细胞膜上的受体结合，起着第一信使的作用，活化细胞膜腺苷酸环化酶，促使cAMP形成；然后cAMP作为第二信使，激活细胞内抗病毒作用机制，产生AVP。AVP主要有3种：蛋白激酶、磷酸二酯酶和2－5A合成酶。前2种能破坏细胞核糖体转译病毒蛋白质，后一种酶能降解mRNA，有的能抑制转录酶，阻止mRNA的形成，还有的能抑制病毒DNA和RNA的合成。因此，可以说IFN是通过AVP间接地抑制病毒复制而达到抗病毒作用的。

（2）抗肿瘤作用IFNⅠ、Ⅱ型都具有抗肿瘤作用，但IFNⅡ型效果更为显著。干扰素抗肿瘤机制有以下几种方式：①有些肿瘤的发生与病毒有关，IFN通过抑制了病毒的增殖而抑制肿瘤的发生与成长。②IFN作用于细胞膜，刺激腺苷酸环化酶，使cAMP增加，抑制了DNA的合成及细胞分裂。③IFN能改变肿瘤细胞表面的性能，诱发新的抗原，从而易被免疫监视细胞识别并加以排斥。④通过免疫调节，增强机体抗肿瘤能力，主要是增强巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞的杀伤性。1999年，Plachy等进行了鸡重组IFN防治RSV肿瘤的研究，结果表明高剂量的重组IFN不仅可以抑制肿瘤，还可以使一些鸡的RSV肉瘤完全消失（鸡干扰素研究进展，家禽科学，2010，(5):46-48）。临床上可用于治疗鸡马立克氏疾病、鸡白血病、网状内皮组织增殖病、火鸡淋巴细胞增殖病等。