[发明专利]一种鸭黄病毒检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

i、RNA提取试剂，包括Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水；

ii、反转录PCR试剂，包括反转录反应试剂和PCR反应试剂；

所述反转录反应试剂包括0.2μg/μl的Random primer、DEPC水、5×buffer、10mM的dNTP、20u/μl的Rnase抑制剂、200u/μl的M-MuLV以及样品总RNA；

所述PCR反应试剂包括20u/μl的ExTaq酶、10mM的鸭黄病毒通用上游引物DFV-F、10mM的鸭黄病毒通用下游引物DFV-R，2.5mM的dNTP、10×buffer；

所述鸭黄病毒通用上游引物DFV-F为5′-AATTCGACACATGAGATGTAC-3′；

所述鸭黄病毒通用下游引物DFV-R为5′-CCAAGCCACATGTACCA-3′；

iii、鸭黄病毒鸭胚尿囊毒阳性对照和阴性样品。

2.根据权利要求1所述的鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂扩增获得的PCR产物为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂扩增获得的PCR产物为与SEQ ID NO:1所示同源性在99%以上的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的鸭黄病毒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，其步骤包括：

第一步，从待测鸭胚尿囊液样品中提取总RNA，其提取方法是：1.5mlEP管中加0.2ml待测鸭胚尿囊液样品后，加入0.8ml Trizol试剂，混匀，室温静置10-30min；加0.2ml氯仿，振荡混匀15s，室温静置10-15min；4℃，12000g离心15min；取水层，加等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；4℃，12000g离心10min；弃去上清，加1ml 75%乙醇，4℃，7500g离心5min；弃去上清，沉淀干燥5-10min，加20μl DEPC水溶解，得总RNA；

第二步，以所述第一步提取的总RNA为模板，进行反转录反应，反转录反应的步骤为：1μg总RNA加1μl Random primer加DEPC水至12μl，65℃冰浴5min；再加4μl 5×buffer、2μl 10mM dNTP、1μl RNase抑制剂、1μl M-MuLV、混匀，25℃5min，42℃1h，70℃5min，得反转录产物；

第三步，以所述反转录产物为模板，进行PCR扩增，所述PCR体系为：ExTaq酶0.25μl，10mM的引物DFV-F和10mM的引物DFV-R各2μl，2.5mM的dNTP 4μl，10×buffer 5μl，模板2.5μl，加水至50μl；所述PCR反应体系的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环，72℃延伸10min；

第四步，取所述第三步PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后判断结果。

5.根据权利要求2所述的鸭黄病毒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，扩增获得的PCR产物为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求2所述的鸭黄病毒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，扩增获得的PCR产物为与SEQ ID NO:1所示同源性在99%以上的核苷酸序列。