[发明专利]一种鸭黄病毒检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及一种鸭黄病毒检测试剂盒及其检测方法。

技术背景

蛋鸭新减蛋综合征是2010年4月在宁波乃至全国新爆发的一种疫病，本病来势凶猛、传播迅速，造成宁波市养鸭户经济损失至少6000万元。据国家水禽体系专家初步统计，本病在养鸭业造成的损失至少100亿元。

目前已知的蛋鸭新减蛋综合征是由一种与坦布苏病毒同源性很相近的黄病毒属的病毒引起的传染病，有研究者称该病原为鸭坦布苏病毒也有称鸭黄病毒。为了有效保护养鸭产业的健康发展，以减少养鸭业的经济损失，确保农民利益，需要对本病的病原鸭黄病毒的特性、检测方法和防控措施等进行系列、深入的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鸭黄病毒检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高，结果准确，可以在蛋鸭感染减蛋综合征的早期阶段对从病鸭采集的病料进行快速、灵敏、准确的检测，同时也可以对病毒分离物鸭胚/鸡胚尿囊液进行检测验证，使对该病的防控及时采取措施，大大减少了蛋鸭新减蛋病造成的危害。

本发明所要解决的技术问题还在于提供上述鸭黄病毒检测试剂盒的检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种鸭黄病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括：

i、RNA提取试剂，包括Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水；

ii、反转录PCR试剂，包括反转录反应试剂和PCR反应试剂；

所述反转录反应试剂包括0.2μg/μl的Random primer、DEPC水、5×buffer、10mM的dNTP、20u/μl的Rnase抑制剂、200u/μl的M-MuLV以及样品总RNA；

所述PCR反应试剂包括20u/μl的ExTaq酶、10mM的鸭黄病毒通用上游引物DFV-F、10mM的鸭黄病毒通用下游引物DFV-R，2.5mM的dNTP、10×buffer；

所述鸭黄病毒通用上游引物DFV-F为5′-AATTCGACACATGAGATGTAC-3′；

所述鸭黄病毒通用下游引物DFV-R为5′-CCAAGCCACATGTACCA-3′；

iii、鸭黄病毒鸭胚尿囊毒阳性对照和阴性样品。

上述鸭黄病毒检测试剂盒的检测方法，其步骤包括：

第一步，从待测鸭胚尿囊液样品中提取总RNA，其提取方法是：1.5mlEP管中加0.2ml待测鸭胚尿囊液样品后，加入0.8ml Trizol试剂，混匀，室温静置10-30min；加0.2ml氯仿，振荡混匀15s，室温静置10-15min；4℃，12000g离心15min；取水层，加等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；4℃，12000g离心10min；弃去上清，加1ml 75%乙醇，4℃，7500g离心5min；弃去上清，沉淀干燥5-10min，加20μl DEPC水溶解，得总RNA；

第二步，以所述第一步提取的总RNA为模板，进行反转录反应，反转录反应的步骤为：1μg总RNA加1μl Random primer加DEPC水至12μl，65℃冰浴5min；再加4μl 5×buffer、2μl 10mM dNTP、1μl RNase抑制剂、1μl M-MuLV、混匀，25℃5min，42℃1h，70℃5min，得反转录产物；

第三步，以所述反转录产物为模板，进行PCR扩增，所述PCR体系为：ExTaq酶0.25μl，10mM的引物DFV-F和10mM的引物DFV-R各2μl，2.5mM的dNTP 4μl，10×bufer 5μl，模板2.5μl，加水至50μl；所述PCR反应体系的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环，72℃延伸10min；

第四步，取所述第三步PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，用EB染色，在紫外光下观察，看到明亮的DNA条带为阳性结果，如无肉眼可见的条带则为阴性结果。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

（1）本发明试剂盒能特异地检测到从疑似病料中分离到的3株鸭黄病毒，而对其它禽病病毒如鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒、小鹅瘟病毒、流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒检测结果为阴性。该试剂盒可以最低检测到3.2ng/ul的反转录产物cDNA。因此该试剂盒检测灵敏度高，结果准确，可以在蛋鸭感染黄病毒后对其进行快速、灵敏、准确的检测，大大减少了蛋鸭新减蛋综合征造成的危害。