[发明专利]一种从植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于药物筛选与评价方法领域，涉及一种从植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂的方法。

背景技术

甘油三酯是人体内含量最多的脂类，脂肪组织中的甘油三酯在一系列脂肪酶的作用下，分解生成甘油和脂肪酸，这一过程称为脂动员。脂动员生成的脂肪酸可释放入血，与白蛋白结合形成脂酸白蛋白运输至其它组织被利用；甘油被运输到肝脏，被甘油激酶催化生成3-磷酸甘油，进入糖酵解途径分解或用于糖异生。

在脂动员过程中，催化由甘油三酯水解生成甘油二酯的甘油三酯酶是脂动员的限速酶。若能获得具有高效抑制剂抑制该酶的活性，就能有效降低糖尿病患者体内血糖含量。

天然产物中含有丰富的具有生物活性的成分，是开发新药候选化合物的巨大资源库。但是目前针对天然药物的开发并没有形成如化学药物开发那样的规模，其中最大的技术难度在于天然产物中活性化合物的筛选效率太低。常规方法大都采用有机溶剂对天然产物进行系统分离，制得的样品需要干燥、称量、溶解、配制、加样等一系列步骤后才能进行活性评价，存在耗时耗力等问题。因此，开发针对特定酶靶标活性化合物的快速分离与鉴定方法可以极大地提高天然产物中活性化合物发现的速度。

目前，基于亲和选择的活性化合物富集技术在天然产物活性成分筛选中的应用越来越多。这类方法包括亲和超滤法、亲和磁珠富集法、亲和细胞膜色谱法等。根据所采用的靶标固定方式不同，可将这些方法分为两类：溶液化酶和固定化酶。固定化酶的方法即采用各种不同介质将靶标蛋白或酶固定在其表面，从复杂混合样品中分离活性化合物，再通过液相色谱-质谱联用等手段分析固定介质上吸附的活性化合物，从而实现化合物的快速发现。

酶的固定化方法主要有吸附法、共价结合法、包埋法及交联法四大类。其中吸附法应用范围较广，包括物理吸附法和离子吸附法。其突出优势在于工艺简单，操作条件温和；不易破坏酶分子的高级结构以及活性中心的构象，酶回收率较高；载体选择范围大且大多廉价易得；吸附过程还能达到酶纯化的目的。

物理吸附法主要以高吸附能力的非水溶性材料为载体，如硅藻土、分子筛、硅胶、多孔玻璃、氧化铝、大孔吸附树脂等。中空纤维材料具有良好的吸附性能，能够将靶标蛋白或酶吸附在其中，从而很有潜力成为新的固定介质。然而，以往研究从未将中空纤维应用于天然药物中活性化合物的发现中。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种从植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂的方法，使用该方法能快速筛选获得植物提取物中具甘油三脂酶抑制活性的化合物。

本发明的技术方案为：

一种从植物提取物中筛选甘油三酯酶抑制剂的方法，包括利用吸附载体进行酶的固定化，以及利用负载有酶的吸附载体从植物提取物中亲和选择分离出活性化合物，所述吸附载体为中空纤维。

本发明中采用中空纤维作为吸附载体是因为中空纤维的比表面积较大，能大大增加酶的吸附量，进而提高筛选效率，且吸附过程不会对酶的活性产生影响。

作为优选，所述吸附载体为聚丙烯中空纤维。聚丙烯中空纤维材料价格便宜，操作过程中不易折断损伤，使用方便，能够降低筛选成本、提高筛选效率。

优选的聚丙烯中空纤维的规格为300～400μm内径，80～120μm壁厚，0.1～0.3μm孔隙大小，40～60％孔隙率。

所述酶的固定化方法为：

(1)将中空纤维浸泡在乙醇中活化；

(2)取出中空纤维用去离子水清洗；

(3)活化好的中空纤维垂直放入酶溶液中，搅拌孵育。

所述酶溶液为甘油三酯酶溶液，使用的溶剂为水或磷酸缓冲液。

所述植物提取物的获取方法为：

(1)收集植物组织，使用乙醇水溶液回流提取，浓缩提取液得到样品A，此步骤的乙醇水溶液中，乙醇的体积百分比浓度优选70％；

(2)样品A上样于大孔树脂，使用体积比呈梯度分布的乙醇水溶液洗脱，合并目标洗脱液，浓缩得到样品B；

(3)样品B上样于阳离子交换树脂，使用体积比呈梯度分布的乙醇水溶液洗脱，合并目标洗脱液，浓缩即得到植物提取物。

作为优选，所述大孔树脂为D101大孔树脂。

作为优选，所述阳离子交换树脂为732型阳离子交换树脂。

为确保所述中空纤维能有效吸附甘油三酯酶，在活性化合物的亲和选择分离之前，要对吸附酶的中空纤维进行吸附质量考察，考察方法包括：电镜扫描、衰减全反射红外光谱测定或X光电子能谱分析。