[发明专利]一种高效表达抗癌基因的受特定miRNA调控的在胶质瘤细胞中特异增殖的腺病毒及其用途

说明书

发明领域：

本发明一般的涉及重组腺病毒载体。跟具体地说说，本发明涉及一种基于miRNA的调控可在胶质瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体以及其构建方法和用途。

背景技术：

基因治疗是一种新型的治疗手段，可治疗多种疾病，包括癌症、遗传病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。过去几年里，全世界的基因治疗取得了巨大的进步。截止2008年9月，临床试验总数已达1432项，第一个基因治疗药物-“今又生”已由我国深圳赛百诺公司自主研发，并获准上市（参见http://www.wiley.co.uk/genmed/clincal/）。

腺病毒是目前基因治疗最常见的载体之一，全球近1/4的基因治疗临床试验方案采用腺病毒作为载体。腺病毒相比较于其他载体的优势在于：（1）装载容量大；（2）能够感染的细胞种类广泛，转导率较高，能够有效转导分裂期和非分裂期的细胞；（3）在细胞中以游离状态存在，不整合到靶细胞基因组中，因而不会引起插入突变，无致癌性；（4）滴度高（可达10¹²vp/mL），稳定性好，便于储存和运输，易于规模化生产和运输。

人腺病毒分为A，B，C，D，E，F六个亚属共49个血清型。目前应用于基因治疗的腺病毒载体绝大多数是C亚属的2及5血清型腺病毒。随着病毒学，分子生物学等学科的发展，人们已经完成了多个腺病毒全基因组的测序，并对其基因的结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对腺病毒基因进行改造。例如，以组织特异性启动子调控E1A、E1B的表达、缺失E1A的长度为24bp的 Rb蛋白的结合区、缺失E1B 55kD、19kD基因等。改造后的腺病毒能在目标细胞内进行选择性复制和增殖，而在正常细胞内，増殖能力被大大削弱。

但是，改造后的腺病毒载体仍存在一定的问题，以肿瘤基因治疗为例，首先，肿瘤产生的机制非常复杂，异质性很强，病人和病人之间，肿瘤与肿瘤之间，同一肿瘤的不同肿瘤细胞之间均存在明显差异。例如，端粒酶虽然已被报道在肿瘤中异常表达，但其表达量变化较大，在某些病人、肿瘤类型或某些肿瘤细胞群体中其表达情况与正常细胞无异，这使得端粒酶启动子调控E1A的重组腺病毒载体在这种情况下不能选择性的在肿瘤细胞中有效增殖，从而影响治疗效果。其次，肿瘤组织中的物理因素如纤维化，混入正常细胞以及坏死区域也可能限制腺病毒扩散。再次，某些肿瘤细胞膜上的科萨奇腺病毒受体表达量低限制了腺病毒的感染效率。第四，病人的免疫反应限制腺病毒的増殖和扩散。目前，美国ONYX药物公司尝试单独应用E1b 55kD蛋白缺失的腺病毒（ONYX-015治疗肿瘤，其临床的有效率仅为15-20%（Nemunaitis et al.，2000；US 5677178；US 5801029）

因此，基因治疗领域非常需要可以选择性地在肿瘤细胞中增殖而在正常细胞中不增殖的腺病毒载体系统。从而实现更有效，更特异地在肿瘤细胞中表达外源基因，同时最大限度地避免对正常细胞的细胞毒性。

微小RNA（microRNA）是生物体內源的小片段RNA，通过与靶基因成熟mRNA的3端非翻译区中的靶点核苷酸序列，抑制靶基因蛋白的翻译。微小RNA具有高度的组织特异性和时序性，在不同类型的细胞中表达水平差异大。近几年的研究表明，微小RNA表达的失调和肿瘤发生相关，多个在正常组织细胞中的表达的微小RNA在肿瘤细胞中表达确实或显著下调。

因而可借助微小RNA的调控机制及其在肿瘤组织与正常组织的表达差异，利用在肿瘤细胞中表达确实或降低而在正常细胞中表达正常的微小RNA调控腺病毒的増殖必需基因的表达不受影响，能大量増殖与复制，达到治疗目的。

 

发明内容

发明目的

为了使得腺病毒载体选择性地在胶质瘤细胞中增殖而在正常神经和胶质细胞中不增殖，同时最大限度地避免对正常细胞的细胞毒性，我们构建由胶质瘤细胞低表达的微小RNA靶位点调控其增殖的腺病毒载体。

技术解决方案

本发明提供了一种重组腺病毒载体，其特征在于：在该腺病毒载体的至少一个増殖必需基因的3端非翻译区中插入至少一个微小RNA靶位点：所述微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或降低而在正常细胞中表达正常。