[发明专利]转基因玉米BT11品系的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于食品检验技术方法领域，具体涉及一种食品中转基因玉米BT11品系环介导等温扩增（LAMP）引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

玉米是世界上重要的粮食作物之一，其单位面积产量位居榜首。世界范围内玉米害虫高达350多种，其中以鳞翅目的玉米螟分布最广、危害最重，是世界性的重要玉米害虫，其严重影响着玉米的产量和品质。近十多年来，转基因植物培育取得突破，推出了一批新品种，在改善农作物生产中发挥了明显的作用，也显露出巨大的潜力。然而，人们对转基因玉米的安全性存在着很多的争论。面对生物基因工程技术对我国经济利益带来的冲击和国外转基因产品对生态环境和消费者可能带来的风险，对转基因玉米进行检测具有重要的现实意义。2009年，我国已经解除了对玉米进口的限制，大批量的玉米已经涌入中国。这势必对我国的农业安全带来冲击。

Bt11转基因玉米品系是瑞士先正达种子有限公司研发的产品，是DNA直接转化先天玉米品系H8540，并在选择性培养基上培养而出的，具有抗欧洲玉米螟(ECB;Ostrinia nubilalis)的抗性，也可以抗草甘膦除草剂。在2004年4月6日首次获得中国农业部颁发的安全证书，是目前用于加工食品和饲料最多的品系之一。

目前，转基因玉米成分检测方法主要为TaqMan实时荧光PCR方法和普通PCR方法。普通PCR方法由于操作繁琐，污染环境、灵敏度低等不足已逐渐被实时荧光PCR检测方法所取代。但是TaqMan实时荧光PCR检测对技术要求相对较高且成本昂贵，目前急需制定在检验检疫一线的基层实验室能够普遍适用的快速、简便、准确的标准检测方法。

国内发布的食品转基因玉米BT11品系特异性检测标准有：GB/T 19495.5－2004《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》、SN/T 1196-2003《玉米中转基因成分定性PCR检测方法》、SN/T 1201-2003《植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法》和农业部869号公告-3-2007《转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种定性PCR方法》，这4个标准均采用实时荧光PCR方法或普通PCR方法。

国外发布的转基因玉米BT11品系特异性检测技术是欧盟发布的官方检测方法“Event-specific Method for the Quantification of Maize Line Bt11 Using Real-time PCR(CRLVL10/07VP)”，该方法采用的是实时荧光PCR方法。国内外相关标准的要求：由于欧盟是最为关注食品转基因成分的地区，多年来不断更新检验监管规定和检测技术要求，因此玉米转基因BT11品系的标准检测方法历来主要依据欧盟规定的方法，国内相关标准也是参考欧盟的技术文件制定的。目前，转基因玉米BT11品系标准检测方法的文献依据是欧盟发布的官方方法“Event-specific Method for the Quantification of Maize Line Bt11 Using Real-time PCR(CRLVL10/07VP)”，国内的GB/T 19495.5－2004《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》也规定了同样的技术内容。这些方法采用的均是TaqMan实时荧光PCR方法，最低检出限为0.5%。

随着分子生物学理论和技术的快速发展，以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础的新型鉴定技术已日益得到广泛应用。环介导等温扩增法（LAMP，Loop-mediated Isothermal Amplification）是在PCR基础上创建的一种较理想的手段，其特点是：①只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性；②高特异性：采用六个区段，四条引物，扩增特异性高，可以根据是否扩增来判断目标基因的存在与否；③快速、高效扩增：扩增在不到1h即可完成，且产率高；④灵敏度高：扩增模板可达10拷贝或更少；⑤鉴定简便：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可用肉眼观察判断扩增与否；另外，它利用恒温和低反应温度（63℃），减少细胞损伤，检测人员实际操作非常简便。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系，在转基因食品检测等领域具有广阔的应用前景。

目前尚未发现LAMP方法应用于食品转基因成分检测的标准化研究。

发明内容