[发明专利]一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法

权利要求书

1.一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为：

5'tt ccaggttatg agtgtggtgt caggcttcag tcctcttatc agtgctggga ttttctctgccacactttcc tctgccctgg catctctcgt cagtgcccca aaagtgtttc aggctttatgcaaagacaat atctatcctg gaattgcaat ttttggaaag ggctatggca agaacaacgagcccctgcga ggatattttc ttacctttgg cattgcgtta gcttttattc taattgcgga gttgaacgtcattgccccaa tcatttccaa ctttttcctg gcatcatacg ctctcatcaa cttctcggtg tttcacgcttcgctggccaa ttcccctgga tggaggccaa gcttcaagta ctacaacatg tgggcgtctctggccggggc aatcctatgt tgtgttgtca tgtttatcat caattggtgg gcagcgcttttgaccaacgt cattgtctta tccctttaca tctacgtcag ctacaaaaaa ccagatgtgaattggggttc gtcaac 3'。

2.如权利要求1所述探针的设计方法，其特征在于：

(1)根据KCC2的Gene bank序列设计KCC2特异的引物，并且此对引物扩增出518bp的KCC2片段作为KCC2特异的探针序列；

(2)构建KCC2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；

(3)制备KCC2的cRNA原位杂交探针；

(4)检测KCC2的cRNA探针的原位杂交。

3.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(1)中KCC2特异的引物是：

上游引物是5'CTA CTT CAC CCT GCT CGT TG 3'；

下游引物是5'GCA CAA GCC AAG TTC ACA AA 3'。

4.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(2)按照如下步骤进行：

(a)将小鼠的cDNA用KCC2特异的引物进行PCR扩增；

(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；

(c)将回收后的产物于4℃与多克隆位点两端具有T7、SP6启动子的载体进行连接；

(d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。

5.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)按照如下步骤进行：

(a)步骤(2)得到的细菌测序正确后，经判断确认KCC2探针序列插入载体的顺序是反向的；

(b)需要使用XbaⅠ限制性内切酶对质粒进行酶切；

(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；

(d)用T7RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。

6.如权利要求2所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(4)按照如下步骤进行：

(a)将小鼠用0.4%戊巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉，用0.01mol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的0.01mol/L DEPC-PBS是2.9克磷酸氢二钠，0.29克磷酸二氢钠，9.0克氯化钠用超纯水定容至1L后，再加入体积百分比为0.1%的DEPC1ml过夜放置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述4%的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸馏水加热使之解聚溶解后，再加入500.0ml的0.2mol/L PB缓冲液定容至1000ml；所述0.2mol/L PB缓冲液是用29.01克磷酸氢二钠，2.96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml；

(b)取材后进行脑组织的后固定：于4℃，用4%的多聚甲醛后固定24小时；

(c)将固定好的组织进行切片：将组织切成25~30μm组织切片，并将切好的切片保存与0.01mol/L的DEPC-PBS中，放于4℃冰箱备用；

(d)将切好的组织片用0.01mol/L的DEPC-PBS清洗1次，室温，每次5-10分钟；

(e)将上述清洗过的片子用5x SSC清洗2次，室温，每次5-10分钟；所述5x SSC是由20x SSC用超纯水稀释的，20x SSC为一种缓冲液；

(f)将5x SSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55℃，在杂交炉孵育1-2小时；所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺，2.5ml的20x SSC溶液，200μl的50x Denhardt’s溶液，50μl的浓度为200mg/ml的Heperine溶液，100μl的浓度为10mg/ml的tRNA溶液，100μl的浓度为10%的CHAPS溶液，100μl的浓度为10%的Tween-20溶液，100μl的浓度为0.5mol/L的EDTA溶液和1.85ml的DEPC-H₂O混合配置而成；

(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55℃，在杂交炉中孵育16-20小时；所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为1.0ug/ml的cRNA探针配置成的；

(h)杂交后用1x SSC洗涤杂交的组织切片，37℃，2次，每次10分钟；

(i)用2xSSC洗涤上述的组织切片，37℃，2次，每次10-15分钟；

(j)用10ug/ml的RNase A处理，37℃，1次，每次30-40分钟；

(k)用2x SSC洗涤上述的组织切片，室温，1次，每次10分钟；

(l)用0.01mol/L PBS洗涤上述的组织切片，室温，1次，每次10分钟；所述0.01mol/L PBS是2.9克磷酸氢二钠，0.29克磷酸二氢钠，9.0克氯化钠用超纯水定容至1L配置的磷酸缓冲液；

(m)按1:2000的抗体效价，在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin–AP抗体，对洗涤后的组织切片进行孵育，室温，放置过夜；

(n)将经过上步抗体孵育的组织片进行PBS的洗涤，于室温，清洗3次，每次10-15分钟；

(o)用TS9.5洗涤上述PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，每次15-20分钟；所述TS9.5为是由终浓度为摩尔浓度为0.1mol/LTris-HCl、PH9.5,摩尔浓度为0.1mol/L NaCl溶液和摩尔浓度为50mmol/L MgCL₂用超纯水配制而成；

(p)将上述切片放于NBT-BCIP反应液中避光孵育4~6小时，在此过程中观察切片呈色强度；所述NBT-BCIP是一种Roche公司生产的呈色反应液；

(q)当呈色完成后，将切片用PBS清洗3次，室温，每次10-15分钟；

(r)将上述洗涤后切片表于载玻片上；

(s)晾干切片，再经过二甲苯脱色，封片，以备观察。