[发明专利]一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种探针及其设计方法，尤其是一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法。 

背景技术

氯离子是细胞内最重要阴离子。在神经系统，神经元内外氯离子浓度保持相对平衡状态，是维持神经元和局部环路形态和机能稳定的内环境基础。一旦氯离子失去平衡，将直接导致神经系统疾病产生。目前已经发现，氯离子失衡可导致是包括帕金森病、癫痫、缺血缺氧、阿尔茨海默病、脑震荡、神经病理性痛、脊髓损伤、糖尿病性神经病、精神分裂症和小脑共济失调等多种神经系统疾病的重要因素。氯离子是由细胞膜上的氯离子转运体负责运入或者运出细胞。目前为止共克隆得到8个氯离子转运体蛋白分子：包括2个NKCC蛋白、4个KCC蛋白、1个NCC蛋白以及1个CIP蛋白。KCC2是神经系统内最重要的升高神经元内氯离子浓度的蛋白。KCC2全名为钠离子钾离子浓度梯度驱动的氯离子内向转运体。KCC2的工作原理是：按1∶1∶2的比例将1个钠离子和1个钾离子转运出胞体，而同时将2个氯离子转运入胞体。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案来解决的： 

一种KCC2基因cRNA原位杂交的探针，该探针的序列为： 

5'tt ccaggttatg agtgtggtgt caggcttcag tcctcttatc agtgctggga ttttctctgccacactttcc tctgccctgg catctctcgt cagtgcccca aaagtgtttc aggctttatgcaaagacaat atctatcctg gaattgcaat ttttggaaag ggctatggca agaacaacgagcccctgcga ggatattttc ttacctttgg cattgcgtta gcttttattc taattgcgga gttgaacgtcattgccccaa tcatttccaa ctttttcctg gcatcatacg ctctcatcaa cttctcggtg tttcacgcttcgctggccaa ttcccctgga tggaggccaa gcttcaagta ctacaacatg tgggcgtctctggccggggc aatcctatgt tgtgttgtca tgtttatcat caattggtgg gcagcgcttttgaccaacgt cattgtctta tccctttaca tctacgtcag ctacaaaaaa ccagatgtgaattggggttc gtcaac3'。 

所述探针的设计方法，按照如下步骤： 

(1)根据KCC2的Gene bank序列我们设计了KCC2特异的引物，并且此对引物扩增出518bp的KCC2片段作为KCC2特异的探针序列； 

(2)构建KCC2的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序； 

(3)制备KCC2的cRNA原位杂交探针； 

(4)检测KCC2的cRNA探针的原位杂交。 

所述步骤(1)中KCC2特异的引物是： 

上游引物是5'CTA CTT CAC CCT GCT CGT TG 3'； 

下游引物是5'GCA CAA GCC AAG TTC ACA AA 3'。 

所述步骤(2)按照如下步骤进行： 

(a)将小鼠的cDNA用设计的引物进行PCR扩增； 

(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； 

(c)将回收后的产物于4℃与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接； 

(d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。 

所述步骤(3)按照如下步骤进行： 

(a)步骤(2)的到的细菌测序正确后，经判断确认KCC2探针序列插入载体的顺序是反向的； 

(b)需要使用XbaⅠ限制性内切酶对质粒进行酶切； 

(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收； 

(d)用T7RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。 

所述步骤(4)按照如下步骤进行： 

(a)将小鼠用0.4%戊巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉，用0.01mol/L的DEPC-PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；