[发明专利]利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法

权利要求书

1.一种利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，该构建方法包括：

sbe2b RNAi载体的构建：玉米sbe2b基因在胚乳中特异表达，选用sbe2b启动子驱动干涉片段的表达，通过对sbe2b基因进行在线同源比对，发现其第九外显子特异性较高，因此我们设计引物扩增第九外显子及内含子部分序列315bp和第九外显子反义序列155bp，同时扩增sbe2b启动子，将上述三片段同时连入pCAMBIA3301载体的多克隆位点MCS中；

ss1过表达载体的构建：利用ss1基因启动子驱动玉米ss1基因的表达，将ss1启动子片段及ss1基因cDNA片段替换MCS中含sbe2b RNAi三片段的pCAMBIA3301载体的35S及GUS片段，因此该表达载体同时含有sbe2b启动子控制的反义sbe2b cDNA片段和ss1启动子控制的ss1全长cDNA片段。

2.如权利要求1所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，sbe2b RNAi载体的构建方法包括：

①sbe2b启动子扩增；

②sbe2b第九外显子正反片段及内含子扩增；

③质粒提取及酶切。

3.如权利要求2所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，sbe2b启动子扩增，引物自行设计，结构为：

Psbe2b-F：aagctTGAAGAGAGAATGAAAGCGAACTG

Psbe2b-R：gaattcGGATCGAACTGATCAGCCAATG

PCR反应体系及程序如下：

将扩增片段经过电泳胶回收后连接入pMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5a细胞，挑取阳性克隆并测序验证。

4.如权利要求2所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，sbe2b第九外显子正反片段及内含子扩增，引物自行设 计，结构为：

正义第九外显子及内含子部分序列315bp：

2b315-F：gaattcTTCATGACATCTGATCACCAG

2b315-R：ggatccGAATTGCTGACACCAACAGCT

第九外显子反义序列155bp：

2b155-F：ggatccTTATACACCCCAGGCTTTCGAC

2b155-R：cccgggTTCATGACATCTGATCACCAG

PCR及后续T载体克隆实验见①sbe2b启动子扩增。

5.如权利要求2所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，质粒提取及酶切，sbe2b启动子用HindIII及EcoRI双酶切；正义第九外显子及内含子部分序列315bp，用EcoRI及BamHI双酶切；反义序列用BamHI及SmaI双酶切；经改造MCS中含NOS终止子的pCAMBIA3301载体用HindIII及SmaI双酶切。

6.如权利要求1所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，ss1过表达载体的构建方法为：

①ss1基因及启动子克隆；

②质粒提取及酶切。

7.如权利要求6所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法，其特征在于，ss1基因及启动子克隆，ss1启动子引物，：根据课题组首次克引物为：

Pss1-F：aagcttACGCTGCAGCGAGAGGCGGGATC

Pss1-R：ggatccTGCGGAGAGGGAGAGCAGACAG

ss1基因编码区引物：

ss1-F：ggatccATGGCGACGCCCTCGGCCGTGG

ss1-R：cacgtgTTACATGACATAGGGTCGATC。

8.如权利要求6所述的利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构 建方法，其特征在于，质粒提取及酶切，ss1启动子用HindIII及BamHI双酶切，ss1基因用BamHI及PmaCI双酶切。