[发明专利]利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种利用基因工程提高玉米直链淀粉含量的双元载体构建方法。

背景技术

要进行目的基因介导的遗传改良，应首先构建相应的表达载体后进行遗传转化。Fromm等(1986)最先开展了玉米遗传转化工作，利用电击法诱导玉米原生质体吸收携带npt II(neomycin phosphotransferase II，氯霉素乙酰转移酶基因)的质粒DNA，电击处理后检测到了该基因在玉米细胞中的表达，进一步将npt II基因转入玉米原生质体，获得了稳定转化的抗性愈伤组织。Rhodes等(1988)利用电击法将npt II酶基因转入玉米原生质体，成功建立玉米原生质体转化系统，首次获得了玉米转基因植株，但转基因植株全部不育。1988年，Grimsly等将玉米条纹病毒基因构建到农杆菌Ti质粒上，利用农杆菌侵染玉米植株，导致了系统感染症状，首次证明了农杆菌可以侵染玉米细胞。1991年Gould等用根癌农杆菌与玉米茎尖共培养获得了转基因植株。后来Gordon-Kamm(1990)等利用基因枪介导法分别将bar基因、GUS基因和LUC基因(luciferase gene，萤光素酶)等转入玉米，获得了转基因植株。Lupotto等(2004)对农杆菌侵染后玉米愈伤组织的培养及诱导条件进了研究，并成功获得转化株。Ishida等(1996年)利用农杆菌介导法转化玉米自交系A188未成熟胚，获得了大量转基因植株，建立了农杆菌介导法高效转化体系，此后这一方法在玉米的遗传转化中得到了广泛的应用。丁群星(1993)等利用微玻璃针注射授粉后10-20h的玉米子房，将苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫蛋白基因转入玉米，获得可育的转基因植株。周逢勇王国英等(1998)博士在国内率先建立了玉米的基因枪和农杆菌转化体系，将Bt杀虫蛋白基因转入玉米，获得抗虫转基因玉米植株。综上所述，虽然在玉米转化中采用的方法有电击法、基因枪介导法、超声波法、微注射法、PEG法和农杆菌介导法等，但基因枪介导法和农杆菌介导法应用的最为成功，技术已相当成熟。授粉后18天左右的幼胚是普遍采用的受体材料，再生能力强，转化效果好。对农杆菌介导法而言，适宜转化的玉米基因型还比较有限，适宜的农杆菌菌系有C58C1和LBA4404，共培养基中加入适量的乙酰丁香酮(AS)、脯氨酸、谷氨酰胺等物质，有利于农杆菌侵染玉米幼胚和提高转化效率。

基因工程改变淀粉主要集中于淀粉含量及品质。在淀粉含量方面主要集中对ADPGPPase焦磷酸化酶基因的操作上，Stark等人(1992)利用突变的大肠杆菌菌株618来源的ADPGPPase基因glgC16(对变构调节不敏感)加上不同的启动子，构建植物表达载体，转化到烟草的愈伤组织中，获得了大量转基因烟草愈伤组织。淀粉含量分析表明，转基因烟草淀粉平均值占干重的10.7％。有些转基因烟草淀粉干重高达27％，而对照非转基因烟草却仅含3.4％的淀粉。用上述表达载体进一步转化马铃薯，成功地获得了转化植株，在转化植株中，淀粉含量平均提高了35％。在减少淀粉含量方面，Muller-Rober等人(1992)利用含有不同启动子和反向连接的ADPGPPase大、小亚基cDNA基因构建表达载体，转化马铃薯，在35S加上反向连接的ADPGPPase大亚基cDNA的融合基因转化植株中，叶片的ADPGPPase活性仅为野生型的5％-30％，块茎中ADPGPPase活性仅为野生型的2％，分析转化植株淀粉含量，结果表明转化植株块茎淀粉含量仅为野生型的5％-3.5％，伴随着淀粉含量的下降，转化植株细胞内可溶性糖显著升高蔗糖和葡萄糖分别占块茎干重的30％和8％。Wang等(2007)把来自于大肠杆菌的glgC16基因转化到玉米中，提高了籽粒中ADPGPPase活性，增加了籽粒重量。在改变淀粉含量的研究之中，多数是针对ADPGPPase的，反映出ADPGPPase在控制淀粉合成速率方面的重要性，但值得指出的是，并非淀粉合成速率仅受AGPPase控制，在玉米中SSS(Soluble starch synthase，可溶性淀粉合成酶)或SBE的作用也相当明显(Jenner，1993)，对它们的表达进行研究，对于提高淀粉含量也具有重要意义。