[发明专利]一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵工程和生物制药领域，尤其是溶氧控制技术在发酵过程优化中的应用，具体为一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法。

背景技术

多杀菌素(spinosad)，又名多杀霉素或剌糖菌素，是由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵后产生的胞内次级代谢产物，其主要活性成分是多杀菌素组分A(spinosyn A)组分D(spinosyn D)。多杀菌素是天然生成的抗生素，对鳞翅目及双翅目等害虫均有良好的防治效果，多杀菌素对昆虫存在快速触杀和摄食毒性，通过刺激昆虫神经系统，导致非功能性的肌肉收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹。与一般杀虫剂相比，多杀菌素兼具生物农药的安全性和化学合成农药的快速性效果，具有低毒、低残留、对昆虫天敌安全、自然分解快等诸多优点。在日益重视环保和安全的今天，多杀菌素作为高效无污染的绿色杀虫剂受到越来越多的关注。

刺糖多孢菌是一种好氧型革兰氏阳性放线菌。溶氧是影响多杀菌素发酵的重要因素之一，罗玉双等将透明颤菌血红蛋白基因转入刺糖多孢菌中，以解决高密度深层培养过程中的供氧不足问题，提高了多杀菌素的产量(罗玉双，中国科学，2012：2：148-157)，证明了溶氧对多杀菌素的生产有着重要的意义。刺糖多孢菌发酵动力学属于生长部分相关型，即菌体生长一段时间后出现多杀菌素大量合成，多杀菌素产量与菌体量积累呈正相关，发酵过程中若溶氧太低将会使糖代谢缓慢，菌体生长不良，产物合成就会受到影响；而溶氧太高则会使菌体生长过于旺盛，底物完全氧化的比例过高，也不利于多杀菌素的合成。有报道，刺糖多孢菌在发酵过程中需将溶氧控制在50％或50％以上(拉维恩.德韦恩.博克招衡等，中国专利文献CN1035391C)，虽然给出了溶氧控制的初步结果，但并没有针对菌体生长和产物合成的需氧量分别进行深入研究。目前，尚未见针对刺糖多孢菌发酵过程中溶氧分阶段控制的研究报道。

发明内容

基于以上问题，本发明的目的是提供一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，该方法可以提高多杀菌素产量，缩短发酵周期。

本发明提供的一种两阶段溶氧控制提高多杀菌素产量的方法，在刺糖多孢菌发酵液制备阶段，当刺糖多孢菌发酵一开始时，调控初始氧体积传质系数k_La至100-130/小时(h^-1)，促进刺糖多孢菌生物量积累；当发酵进入到菌体生长对数生长末期时，再调控初始氧体积传质系数k_La至60-92h^-1，促进多杀菌素合成与积累。

作为上述技术方案的一个改进，所述调控是指调节通气量和搅拌转速。

作为上述技术方案的另一个改进，在刺糖多孢菌发酵液制备阶段之前，该方法还依次包括以下阶段：刺糖多孢菌的孢子制备阶段；刺糖多孢菌的一级种子液制备阶段；以及刺糖多孢菌的二级种子液制备阶段。

作为上述技术方案的进一步改进，所述刺糖多孢菌的孢子制备阶段具体包括下述过程：将刺糖多孢菌冻干管中的冻干粉转接进入斜面培养基中，活化后经过NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)化学诱变、紫外线物理诱变和原生质体融合，得到改良菌株；所述斜面培养基中含有葡萄糖：10.0-15.0；酪蛋白：2.0-3.0；酵母粉：1.0-2.0；琼脂；15.0-20.0，单位：克/升。

作为上述技术方案的再进一步改进，所述刺糖多孢菌的一级种子液制备阶段具体包括下述过程：将所述刺糖多孢菌的孢子制备阶段制得的活化后刺糖多孢菌孢子接入刺糖多孢菌的一级种子培养基中，培养制得刺糖多孢菌一级种子液；所述每升一级种子培养基含有葡萄糖：10.0-15.0；酵母粉：2.0-2.5；酪蛋白：2.0-2.5；K₂HPO₄：0.2-0.4；MgSO₄：0.3-0.4，单位：克/升。

作为上述技术方案的又一更进一步改进，所述刺糖多孢菌的二级种子液制备阶段具体包括下述过程：将所述刺糖多孢菌的一级种子液制备阶段制得的一级种子液以10％(v/v)接种量接入二级种子培养基中，培养制得刺糖多孢菌的二级种子液；所述每升二级种子液培养基中含有葡萄糖：10.0-15.0；酵母粉：2.0-2.5；大豆蛋白胨：8.0-10.0；K₂HPO₄：0.2-0.4；MgSO₄：0.3-0.4，单位：克/升。