[发明专利]鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法

权利要求书

1.鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法，其特征是包括以下步骤：

一、鸡MDH基因5′侧翼区PCR引物的设计

以含鸡MDH基因5′侧翼区的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增鸡MDH基因5′侧翼区，用限制性内切酶PaeI消化PCR扩增产物后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡MDH基因第236位的单核苷酸多态性；

所述的引物P为：

上游引物：5′- TCCTCCAGTTCAATACAAGC-3′ 20；

下游引物：5′-ATCAGTTCCTGTCTGTGCC-3′  19；

二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的MDH基因片段

a、鸡样本的采集

以多只京海黄鸡作为检测对象；

b、待测鸡全基因组DNA模板处理

对上述含鸡MDH基因的待测鸡全基因组DNA模板进行分离、提取、纯化；

c、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个96孔平板中，然后加入经过步骤b处理后的待测鸡全基因组模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增，所述PCR反应体系总量为18-25μL，其中包括10×PCR Buffer1.5-2.5μL、浓度为25mmol/L 的Mg²⁺2-2.5μL、浓度为2 mmol/L的dNTPs0.5-1.5μL、浓度为10 pmol/μL的上、下游引物各1μL、浓度为5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.1-0.5μL、浓度为100 ng/μL的DNA模板0.5-1.5μL和超纯水11-12.5μL，扩增程序为：控制温度为92-96℃，对PCR反应体系进行4-6 min，保持在温度92-96℃，变性处理40-60s，然后降低温度至45-60℃，进行退火处理40-60 s，退火处理完毕后，升高温度至68-76℃，再进行延伸处理40-60 s，将上述的变性处理—退火处理—延伸处理三个步骤按上述的顺序和工艺要求重复30-35个循环，操作完成后控制温度为68-76℃，延伸处理8-11 min，获得多个个体的鸡MDH基因中包含该SNP位点的620-680bp的DNA片段；

三、PaeI酶切消化PCR扩增的MDH基因片段

a、浓度为10μL的PaeI酶切反应消化体系：5 μL PCR产物，限制性内切酶PaeI 5U，10×Buffer 1.0 μL，双蒸水5~6 μL；

b、酶切消化条件：60-70℃恒温水浴消化6~8小时；

四、PaeI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

a、制作1.5%的琼脂糖凝胶，点样后100V电压电泳25~30min；

b、在UV成像系统成像，并拍照；

c、根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性；

MDH基因的第236bp由T突变成C时，PCR扩增的MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCACGC，限制性内切酶PaeI不能识别；而MDH基因产物的第233bp~238bp序列为GCATGC，限制性内切酶PaeI能识别，将扩增片段切为2段，由于鸡为2倍体，所以鸡基因组的MDH基因的第236位的SNP多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为:AA型表现为545bp和112bp两条条带，AB基因型表现为657bp、545 bp和112 bp三条条带，BB基因型表现为657bp一条条带；

d、不同基因型个体PCR产物测序的序列验证

对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序，同时，进行SNP位置分析，结果表明包含657bp的条带、545bp条带和112bp条带的杂合子AB基因型个体其236位的测序图的却表示为T或C，如图3c所示，自左向右第6个峰为两个峰，而AA基因型、BB基因型分别为T、C，如图3a、b所示；

五、MDH基因不同基因频率和基因型频率

基因频率是指在一个群体中某一性状的某种基因型个体占总个体数的比率，P_AA=N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数，N为检测群体的总数量；

基因型频率是指在一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率，计算公式为：P_A=(2N_AA+N_AA1+N_AA2+N_AA3+……+N_AAn)/2N式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中AA纯合子基因型个体的数量，N_AAi表示群体中具有AAi基因型个体数量，A1-An为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。