[发明专利]鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性的检测方法，尤其涉及一种鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法。 

背景技术

苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase，MDH)是细胞内糖的三羧酸循环( TCA)的重要氧化还原酶，在线粒体上, 能催化苹果酸氧化成草酰乙酸；在细胞质中, 又能将草酰乙酸还原成苹果酸，苹果酸脱氢酶穿梭于基质和细胞质之间, 维持着酶促反应的动态平衡，MDH 与LDH（乳酸脱氢酶）的比值可用来反映细胞中氧代谢状况，MDH/LDH比值高表明细胞有氧代谢旺盛，有研究表明心肌的MDH/ LDH 比值显著高于骨骼肌，说明心肌中有氧代谢占优势，这明显有助于维持心脏的正常功能，苹果酸脱氢酶广泛分布于动物各组织，尤以肝、肾、骨骼肌最为丰富，其具有多种生物学功能，但是,不同来源的苹果酸脱氢酶的性质差别很大^[4]，研究表明，牦牛、黄牛和水牛心肌的MDH均显著高于骨骼肌，鸡MDH基因于1996年被克隆研究，其全长106kb，由14个外显子和13个内含子组成，编码557个氨基酸，尽管苹果酸脱氢酶具有重要的生理生化功能, 但迄今为止, 对于苹果酸脱氢酶的研究主要集中在分子生物学领域, 国内曾报道过对猪心苹果酸脱氢酶的提取纯化研究，对酶学性质及其稳定性等方面的研究，多数MDH的单核苷酸突变可以影响基因的后续转录和表达进而改变了酶的结构和功能，这是造成个体差异的主要原因，限饲家兔将导致MDH基因表达的降低，同时降低脂肪的沉积，MDH基因在长链氨基酸的生化合成中起重要作用，MDH基因产物的活性与脂肪酸合成速率有很大关系，在家禽和家兔中，MDH基因的活性与脂肪酸合成的速率成正相关，MDH在脂肪代谢中的作用以及酶活性存在明显差异，因此对MDH基因进行多态性的检测是现有技术急需解决的技术难题。 

经对现有技术文献检索发现，目前对于苹果酸脱氢酶的研究主要集中在分子生物学领域, 主要是对酶学性质及其稳定性等方面的研究，少有对其进行分子遗传效应的研究，仅见GUAN Hong-Ying等在《Acta Genetica Sinica》2006，33：501-506上发表的Correlation Analysis Between Single-Nucleotide Polymorphism of Malate Dehydrogenase Gene 5′-Flanking Region and Growth and Body Composition Traits in Chicken，该文提出采用PCR-RFLP法在F2资源群体和高低脂系检测MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性。 

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法。 

本发明采用的技术方案是：鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤： 

一、鸡MDH基因5′侧翼区PCR引物的设计

以含鸡MDH基因5′侧翼区的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增鸡MDH基因5′侧翼区，用限制性内切酶PaeI消化PCR扩增产物后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡MDH基因第236位的单核苷酸多态性；

所述的引物P为：

上游引物：5′- TCCTCCAGTTCAATACAAGC-3′ 20；

下游引物：5′-ATCAGTTCCTGTCTGTGCC-3′  19；

二、以引物P进行PCR扩增待测鸡的MDH基因片段

a、鸡样本的采集

以多只京海黄鸡作为检测对象；

b、待测鸡全基因组DNA模板处理

对上述含鸡MDH基因的待测鸡全基因组DNA模板进行分离、提取、纯化；

c、PCR扩增