[发明专利]甘露聚糖酶Man23及其基因改造

说明书

技术领域

本发明涉及提取自枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶Man23，克隆出其编码基因man23后经生物学软件设计和筛选获得耐高温和pH适应性好的突变体，重组到表达载体pHY-p43后转化入短短芽孢杆菌的制备方法，属于微生物工程技术领域。 

背景技术

甘露聚糖酶是一类兼具半纤维素酶和纤维素酶活性的胞外酶，能够水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖，它以内切方式断开β-1，4-糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖。 

甘露聚糖酶普遍存在于植物、动物和微生物组织中，已发现的甘露聚糖酶植物源有Coffeaarabica，Daucus carota，Lactuca sativa，Lycopersicon esculentum，Amorphaphallus KonjacC.Koch等。动物源种类较少，而且大多数属于软体动物，如Haliotis discus hannai，Littorinabrevicula，Mytilus edulis等。甘露糖酶的微生物源种类最为丰富，初步统计已发现的可产生甘露聚糖酶的微生物将近100种，其中芽孢杆菌属微生物是研究最多的产甘露聚糖酶的类群，如Bacillus subtilis，Bacillus circulans等。 

通常甘露聚糖酶分为二类，一为内切甘露聚糖酶(endo-mannanase)，这类酶作用于高聚糖分子内部的非结晶区，随机水解甘露糖苷键，截短长链分子，产生大量带非还原性末端的小段糖链。二为外切甘露聚糖酶(exo-mannanase)，这类酶作用于高聚糖线性分子末端，水解产物为一个二糖分子。 

甘露聚糖酶在医药、食品、饲料、造纸、纺织、印染、洗涤、石油开采及生物技术等诸多领域正逐渐得到广泛关注和应用，如甘露聚糖酶可用作某些植物源饮料制品的添加剂，防止饮品出现沉淀，提高品质；甘露聚糖酶是对玉米/豆粕型日粮最有效的饲用酶制剂，甘露聚糖酶与其它半纤维素酶合用可以消除饲料中的抗营养因子，极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率，降低食糜粘度，起到促进肠道有益菌生长和提高畜禽免疫力等作用，有望作为抗生素的替代产品；甘露聚糖酶可与其它酶制剂复配增强洗涤效果；甘露聚糖酶可降解天然纤维素中的半纤维素胶质，替代化学脱胶；甘露聚糖酶还可以用于调控植物的生长发育与繁殖，增强其抗病、抗逆性，是一类新型的植物激素；甘露聚糖酶是一种多功能的促生长剂，它既可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，又能够促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；甘露聚糖酶是天然多糖结构分析和植物细胞破壁的良好工具酶，生成具有增殖双歧杆菌生理功效的低聚糖。 

甘露聚糖酶多数是一个单链结构的蛋白分子，一般以胞外诱导酶的形式存在，而且该酶几乎都是外泌型的，具有易于分离获得，简化下游工艺的优势，对于外泌型的酶蛋白来说，芽孢杆菌表达系统被认为是一种较为理想的异源蛋白质表达系统，不过，芽孢杆菌中有些菌 种的分泌系统存在一些不容忽视的问题。如芽孢杆菌自身能产生并分泌多种蛋白酶，以枯草芽孢杆菌为例，其产生的蛋白酶有七种，分属于丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，其中的中性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶为主要蛋白酶，它们的酶活加起来占总酶活的95％以上。短短芽孢杆菌(B.brevis)是一种几乎不分泌蛋白酶的野生菌株，它有较强的异源蛋白分泌能力，而且胞外蛋白酶活性很弱，如B.brevis 47的胞外蛋白酶活性水平是B.subtilis的1.6％，B.brevis HPD31的蛋白酶活性几乎检测不到。利用B.brevis的这些特点，已构建成功多个有效的外源蛋白分泌载体，尤其用于真核生物蛋白的生产，比其它枯草杆菌更具优势。 

发明内容

本发明的目的是提供一种耐高温高酶活的甘露聚糖酶Man23和其突变体，其中所述甘露聚糖酶及其突变体的DNA序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，核苷酸序列分别为SEQID NO.3和SEQ ID NO.4。 

本发明提供了新的重组甘露聚糖酶，该酶的基因序列包含表达载体pHY-p43和所述突变甘露聚糖酶的编码序列，所述重组基因的表达宿主细胞为短短芽孢杆菌。 

酶活实验结果表明，本发明提供的甘露聚糖酶具有较高的酶活和较好的稳定性。突变酶的催化活力较原始酶活提高了近3倍，催化效率提高了10.8倍，最适反应温度由原来的50℃提高至65℃，80℃时酶的半衰期提高了近7倍，同时酶可在更为宽泛的酸碱范围内保持活力。 

本发明还提供了一种制备重组甘露聚糖酶的方法，该方法包括：