[发明专利]中成药中人参DNA的PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于中成药真伪性的鉴定方法，具体地说是利用PCR技术检测中成药中人参的DNA的一种方法。

背景技术

传统的中成药的质量控制仅限于对药品性状上的鉴别以及化合物的含量测定。中药材制成中成药，原药材经多种制剂工艺制成中成药时其本身的性状已难以辨别；而中药本身成分复杂，一味药就几十甚至数百个化合物，一个由多种中药组成的中成药，其中化学成分就更多了，目前仅选择有限的几种化学成分的鉴定来控制中成药的质量，就为中成药造假者提供了很大的空间，对于某种价格昂贵的中药材，例如人参，在制剂过程中不加入人参药材，仅加入被列为检测项目的化合物，或者以含有同样化合物的其他药材以假充真，本方法通过PCR的扩增，对经过打粉、提取、过滤后的中成药仍可以检测出其中人参的DNA,克服了现有技术的不足，可以简便、快速、准确地判断出中成药中是否使用人参，保证药品质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种PCR检测中成药中人参DNA的方法.

本发明上述方法是利用聚合酶链式反应(PCR)扩增中成药中人参特异性的DNA来检测中成药中的人参DNA。其中所检测中成药为含有拉丁学名为Panax ginseng C.A.Mey.、其别名或其炮制品的中成药。

本发明上述方法包括下列步骤：

1)中成药中人参DNA的提取；

2)PCR反应；

3)PCR扩增产物分析。

上述方法中，步骤1)中对于中成药药材以药材粉末入药的剂型采用改良的CTAB法提取DNA；对于中成药药材以提取液入药的剂型采用乙醇重结晶的方法提取。

其中所述的药材粉末入药的剂型包括片剂、胶囊和丸剂；所述的提取液入药的剂型包括口服液和注射液。

上述方法中，步骤2)中对于DNA含量较高的样本采用普通PCR，对于DNA含量较低的样本采用巢式PCR。

其中所述的普通PCR反应的正向引物和反向引物是以人参ITS2序列区域为模板设计的特异性引物，其目的条带可在80-224bp；所述的巢式PCR对总基因组DNA依次进行第一轮PCR和第二轮PCR两次扩增，第一轮PCR扩增产物的DNA片段可在700-1500bp，第二轮PCR与普通PCR相同。

具体地，本发明提供的一种PCR检测中成药中人参DNA的方法包括下列步骤：

1.中成药中人参DNA的提取：

根据不同的剂型可选择合适的提取方法。

药材粉末入药的药物包括片剂、胶囊、丸剂等剂型采用改良的CTAB法提取。①药材适量在研钵中研磨成细粉取粉末少量(1,5mL EP管的最小刻度0.1mL处)于1.5mL EP管中，加入65℃预热的CTAB提取缓冲液700μl，充分振荡混匀，65℃温浴2h；②样品冷却至室温后加氯仿-异戊醇(24；1)600μl，颠倒混匀5分钟；③7500r.min^-1离心10分钟，转移上清液至一新的EP管中；④加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀，20℃放置30分钟；⑤10，000r.min^-1离心15分钟，弃上清液；⑥沉淀用70％乙醇、无水乙醇各洗涤一次，10，000r.min^-1离心3分钟，弃上清液，室温挥干乙醇，无菌高纯水溶解DNA，备用。所述CTAB提取缓冲液含有：2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，100mM Tris(pH 8.0)，20mMEDTA(pH 8.0)，2.5M NaCl。

提取液入药的包括口服液、注射液等采用乙醇重结晶的方法提取。①10mL药液加入1mL 3M醋酸钠(pH=5.2)，30mL无水乙醇，30μl糖原(glycogen)，-20℃放置1.5h。②14，000r.min^-1离心10分钟，弃上清。③70％乙醇洗涤，16，000r.min^-1离心5分钟，弃上清。④挥干乙醇，无菌高纯水溶解DNA，备用。

2.普通PCR反应体系及条件：

10×Taq buffer 5μl； Taq酶5个单位；

正向引物1μM；        反向引物1μM；

dNTPs 0.2mM；         DNA提取液1μl.

95℃解链3分钟；94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环30次；72℃延伸5分钟，得扩增样品。

3.巢式PCR反应体系及条件：

第一轮PCR：

10×Taq buffer 5μl；  Taq酶5个单位；