[发明专利]Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统及其应用

权利要求书

1.一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示的氨基酸和它们的保守性变体构成的组。

2.一种N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统，所述系统包含：

(i)N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸；

(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；

(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和

(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。

3.如权利要求2所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是含有琥珀反密码子的tRNA，并且所述选择密码子是对应的琥珀密码子，并且其还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。

4.一种宿主细胞，其包含正交tRNA序列和编码权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真细菌细胞，或哺乳动物细胞，优选大肠杆菌细胞和人胚肾(HEK)293细胞。

6.一种产生在至少一个特定位置定点特异插入N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)提供权利要求2所述的N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统，该系统包含：

(i)N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸；

(ii)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；

(iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和

(iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所述特定的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子；和

(b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列以及编码所述目标蛋白质的核酸序列克隆并转化到适当的宿主细胞中，在培养基中加入N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸，在所述蛋白质的翻译期间，N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸氨酰化的正交tRNA识别mRNA上的所述选择密码子以及N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸，从而介导N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸定点插入所述目标蛋白质的特定位置，从而产生在所选位置含N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的所述目标蛋白质。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述正交tRNA是含有琥珀反密码子的tRNA，所述选择密码子是对应的琥珀密码子。

8.生产含有N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的肌红蛋白突变体的方法，其利用权利要求6所述的方法，其中所用的编码肌红蛋白突变体的核酸序列为SEQ ID NO：5，在野生型肌红蛋白的4位引入N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸，所述肌红蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。

9.生产含有N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的增强型绿色荧光蛋白突变体的方法，其利用权利要求6所述的方法，其中所用的编码增强型绿色荧光蛋白突变体的核酸序列为SEQ ID NO：7，在野生型增强绿色荧光蛋白的37位引入N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸，所述增强型绿色荧光蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。

10.由权利要求6-8中任一项所述的方法获得的含有N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸的突变蛋白质的应用，所述突变蛋白质中的N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸在光激发下与四唑官能团化合物反应，生成具有荧光的吡唑啉环，从而实现在体内或体外有效的标记蛋白。