[发明专利]Nε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸翻译系统及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示的氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明还涉及一种N^ε-(1-甲基环丙-2-烯酰胺)-赖氨酸(简写为CpK)翻译系统。更具体地，本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将CpK定点特异插入目标蛋白质的CpK翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入CpK的方法。本发明还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有CpK的突变蛋白质，例如，插入CpK的肌红蛋白和增强型绿色荧光蛋白突变体，以及插入CpK的突变蛋白质的应用。 

背景技术

蛋白荧光标记技术目前已经被广泛应用于蛋白质功能的可视化研究中。荧光蛋白常被用来研究蛋白质在生物体内的表达和定位，但由于它本身体积比较大，往往会影响目标蛋白的生理功能。小分子荧光探针以其体积小、膜透性好、背景噪音低以及制备方便的优点成为蛋白质研究的一个有力工具。但是，把各种不同功能的荧光分子引入到蛋白质中的方法的短缺是限制其应用的瓶颈。因此，发展一种高效的蛋白标记技术对生命科学的研究有着重要的意义。 

为此，生物正交化学提供了令人兴奋的研究生物体中生物分子动力学及功能的新策略。与以配体为基础的方法相比，生物正交化学则需要能与目标生物分子特异性共价结合的探针分子。因此这种方法具有以下独特的优势：(1)能应用到各种各样的生物体分子中，包括蛋白、核酸、碳水化合物和脂质体。(2)用途广泛，探针分子的选择取决于研究人员的想象力。(3)具有高扩展性，适合活细胞中单个目标生物分子功能注释以及一类生物分子的全基因功能分析。由于这些特征，生物正交化学被成功的运用 到可视化蛋白表达，跟踪蛋白定位，测定蛋白活性，鉴定蛋白相互作用和生物体系中蛋白转换等功能研究。 

与其他生物正交反应相比，点击化学由于其具有高选择性、水兼容性和高产率的特点使其在细胞生物学研究中具有巨大的应用前景。光点击化学是由纽约大学的Lin Q.教授提出来的概念，其的主要优点是不需要Cu(I)催化，而是通过光诱导引发反应，并且对细胞没有毒性。这类生物正交反应提供了一种用于研究生物时空分辨和可控引发的化学工具。由于四唑类化合物在紫外光照射下能够释放氮气而原位生成腈亚胺偶极子，该偶极子与烯烃发生瞬间环合生成吡唑啉环加成产物，因此这类反应能够实现时空可控引发。而且吡唑啉环加成产物是有荧光的，这样我们就能用荧光分析来证明特定的环加成产物的生成。近期，已有报道证明降冰片烯能与大环四唑类化合物进行高效地环加成反应，但是由于降冰片烯体积相对较大，有可能会影响蛋白的自身构象，因此我们希望通过扩展基因密码的方法在蛋白的特异性位点掺入含有环丙烯官能团的氨基酸，利用环丙烯官能团与四唑类化合物在一定波长紫外光照射下发生环加成反应，从而进行高效地、可控引发地位点特异性蛋白标记。 

为了能在蛋白的特异性位点掺入含有环丙烯官能团的氨基酸，本领域需要能将环丙烯赖氨酸掺入到蛋白质中的新方案。现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地掺入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸掺入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。