[发明专利]一种利用农杆菌介导的光皮桦转基因方法

权利要求书

1.一种利用农杆菌介导的光皮桦转基因方法，其技术方案按如下步骤进行：

(1)培养基配方

预培养培养基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L(PH5.9)

共培养培养基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+AS300μmol/L(PH5.5)

选一培养基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+Carb500mg/L+Hyg10mg/L

                                                                           (PH5.9)

选二、选三培养基配方：MS+BA0.5mg/L+TDZ0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+Carb500mg/L+Hyg10mg/L

                                                                            (PH5.9)

生根培养培养基配方：1/2MS+IBA1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L   (PH5.9)

AS(乙酰丁香酮)、Carb(羧苄青霉素)和Hyg(潮霉素)都在培养基倒板前温度低于50℃时再加入，防止失效。

(2)光皮桦组培苗的准备

A：种子消毒灭菌：将收集的光皮桦种子放入50ml无菌离心管中，倒入70％酒精消毒1-2分钟；倒去酒精，加入40ml0.1％升汞溶液，浸泡5min；倒去升汞溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。

B：小苗诱导与继代培养：将灭好菌的种子放在无菌滤纸上吸干水分，置入MS培养基中；操作完毕后用封口膜(MicroporeTM Surgical Tape)封好培养皿，在25℃-28℃下光照培养2周；将发芽的小苗置入继代培养基1/2MS，每瓶3-4株，培养2-3个月(25℃-28℃下光照培养)。

(3)预培养

选取长势较好的组培苗的叶片为外植体。选取其前3片较幼嫩的叶片，用剪刀在叶片上剪2-3道伤口(深达叶脉)，较大的叶片可剪成0.5cm大小，接入预培养培养基，每皿40-50片，暗培养7天。

(4)农杆菌培养

挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100μl于5mlYEP(含50mg/LKan和50mg/LStr)培养基中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至饱和，再按0.2％-0.3％的比例，转入含有抗生素的YEP培养基中，

相同条件下培养12-16h，当0D600的值为0.8-1.0时即可用于转化。

(5)转化和共培养

A：取培养好的菌液100ml分装于50ml离心管中，4000rpm，离心20-30min，去上清。用含300μmol/LAS的100mlMS感菌液(PH5.5)制成悬浮液，使菌液0D600终浓度为1.0；

B：将预培养过的光皮桦叶片放入农杆菌悬浮液中侵染20min；

C：取出叶片，置于无菌滤纸上沥干10-20min；

D：将叶片置于共培养培养基上，25℃暗培养5天。

(6)选择培养

A：将共培养好的叶片转入选一培养基中，每皿10-12片或每瓶4-5片，25℃-28℃光照培养3-4周；

B：将选一培养基上长出的带芽原基和微芽的愈伤块，转入选二培养基，每瓶4-5块，光照培养4周；

C：将选二上未达到生根要求的小苗和愈伤继续转入选三培养基，每瓶4-5块，光照培养4周。

(7)生根培养

将长至1cm以上的小苗，转入生根培养基中培养，每瓶接1-2株。

(8)驯化移栽

A、选取长势较好(根部和茎叶分化的较好)的试管苗，打开盖子，炼苗1-3天；

B、将幼苗取出，洗净小苗根部附着的培养基，然后移栽于温室花盆中(基质由泥炭：珍珠岩：蛭石按1∶1∶1配制)，再用1000倍液多菌灵浇透，盖膜一周，每天浇水，保证湿度，促进生根。