[发明专利]一种利用农杆菌介导的光皮桦转基因方法

说明书

1.技术领域

本发明涉及一种利用农杆菌介导培养转基因光皮桦的方法。

2.背景技术

光皮桦(Betula luminifera H.Wink.)为桦木科桦木属的落叶高大乔木，天然分布于我国秦岭、淮河流域以南的14个省区，是木材材质优良的阔叶珍贵用材树种，且具有耐贫瘠、速生、开花早等特性，现已成为中国南方地区杉木、松树地更新的最重要珍贵造林树种，也是良好的林木遗传学研究材料。该树种的育种工作已全面启动，在不同种源区选择了优良单株，并进行杂交创制新种质，建立其转基因技术平台对于开展光皮桦分子育种，创制抗虫、抗旱新种质以及验证已克隆基因的功能等均具有十分重要的作用。

转基因技术指利用分子生物学技术，将某些抗逆、抗病虫等已知功能性状的基因，通过现代科技手段移植到目标生物体中，从而对植物各种性状进行改良的方法。其常用的方法有：农杆菌介导法；基因枪法；电击和聚乙二醇(PEG)法和花粉管通道法。迄今为止，国内外已得到60种以上转基因植物，其中棉花、烟草和大豆等已大面积种植。通过转基因技术，可以改变光皮桦的遗传物质，提高其抗虫、抗旱和木材品质，从而降低生产成本，提高经济效益。

CN200910113862.4公开了谌红辉的“光皮桦叶芽组织培养快速繁殖技术”发明专利技术，以光皮桦叶芽为外植体，诱导再生植株，这种方法虽然繁殖系数较高，但选材时间较难，而采用种子和叶片作为外植体采样比较方便且可以多次采集。

3.发明内容

本发明要解决的技术问题是建立光皮桦组培体系并利用农杆菌介导培养光皮桦转基因植株。

解决上述技术问题的技术方案是按如下步骤进行：

(1)培养基配方

预培养培养基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L(PH5.9)

共培养培养基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+AS300μmol/L(PH5.5)

选一培养基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+Carb500mg/L+Hyg10mg/L

                                                                          (PH5.9)

选二、选三培养基配方：MS+BA0.5mg/L+TDZ0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+Carb500mg/L+Hyg10mg/L

                                                                            (PH5.9)

生根培养培养基配方：1/2MS+IBA1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L   (PH5.9)

AS(乙酰丁香酮)、Carb(羧苄青霉素)和Hyg(潮霉素)都在培养基倒板前温度低于50℃时再加入，防止失效。

(2)光皮桦组培苗的准备

A：种子消毒灭菌：将收集的光皮桦种子放入50ml无菌离心管中，倒入70％酒精消毒1-2分钟；倒去酒精，加入40ml 0.1％升汞溶液，浸泡5min；倒去升汞溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。

B：小苗诱导与继代培养：将灭好菌的种子放在无菌滤纸上吸干水分，置入MS培养基中；操作完毕后用封口膜(MicroporeTM Surgical Tape)封好培养皿，在25℃-28℃下光照培养2周；将发芽的小苗置入继代培养基1/2MS，每瓶3-4株，培养2-3个月(25℃-28℃下光照培养)。

(3)预培养

选取长势较好的组培苗的叶片为外植体。选取其前3片较幼嫩的叶片，用剪刀在叶片上剪2-3道伤口(深达叶脉)，较大的叶片可剪成0.5cm大小，接入预培养培养基，每皿40-50片，暗培养7天。

(4)农杆菌培养

挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100μl于5mlYEP(含50mg/LKan和50mg/LStr)培养基中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至饱和，再按0.2％-0.3％的比例，转入含有抗生素的YEP培养基中，相同条件下培养12-16h，当0D600的值为0.8-1.0时即可用于转化。

(5)转化和共培养