[发明专利]一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因克隆及在大肠菌种的高效表达方法在审
| 申请号： | 201210345153.0 | 申请日： | 2012-09-18 |
| 公开（公告）号： | CN103409449A | 公开（公告）日： | 2013-11-27 |
| 发明（设计）人： | 周哲敏;朱龙宝;崔文璟;周丽;张川 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N9/88;C12R1/645 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 214122 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 酵母 苯丙氨酸 脱氨酶 基因 克隆 大肠 菌种 高效 表达 方法 | ||
【权利要求书】：
1.一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶(PAL)基因克隆及在大肠杆菌中高效表达。
2.权利要求1所述的苯丙氨酸脱氨酶基因来自粘红酵母(Rhodotorula glutinis JN-1)。
3.权利要求2所述的粘红酵母从土壤中分离获得(菌种保藏编号CCTCC NO：M2011490)。
4.权利要求1所述，其特征在于，构建克隆载体pUCm-T-pal和表达载体pET-28a(+)-pal。
5.权利要求1所述，其特征在于，基因克隆宿主菌和表达宿主菌分别是E.coliJM109和E.coliBL21。
6.权利要求1所述，其特征在于，采用IPTG诱导重组菌表达苯丙氨酸脱氨酶。
7.权利要求1所述，其特征在于，采用western blot鉴定重组PAL的成功表达。
8.权利要求1所述，其特征在于，采用HPLC测定重组PAL的酶活。
9.权利要求1所述，其特征在于，采用硫酸铵分级沉淀，阴离子树脂和凝胶过滤三步精制，获得纯的重组PAL。
10.权利要求2所述培养粘红酵母的种子培养基为：1％酵母提取物，1％蛋白胨，0.5％氯化钠，pH6.0；诱导产苯丙氨酸脱氨酶培养基为在种子培养中加入0.1％的L-phe。
11.权利要求5所述的方法，E.coliJM109和BL21的培养基为(LB)：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％氯化钠，pH 7.0。
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