[发明专利]一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因克隆及在大肠菌种的高效表达方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因克隆及在大肠菌种的高效表达方法，属于酶学与酶工程技术领域。

背景技术：

粘红酵母(Rhodotorula glutinis)可以在廉价的原料如玉米粉，糖浆，糖蜜，豆粕，味精废水等工业废料上生长，容易实现大规模的培养，且具有高苯丙氨酸脱氨酶活性，已经在工业上应用其生产L-phe和甜味剂阿斯巴甜。但是由于该酶是诱导酶，在生长对数期酶活达到峰值后，酶活下降较快，稳定性差，菌体不能长时间、重复利用，导致生产成本居高不下。为提高酶活和稳定性，需要采用分子生物手段对酶进行分子改造，构建工程菌，大规模生产高纯度重组酶，用于工业化生产。本专利的方法是克隆粘红酵母PAL基因，构建重组大肠杆菌，实现苯丙氨酸脱氨酶的高效表达。采用硫酸铵分步沉淀，阴离子交换树脂，凝胶过滤精制重组酶，获得纯酶。

发明内容：

本发明的目的是提供粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因克隆及在大肠杆菌中高效表达的方法。

本方法的具体步骤如下：

(1)PAL的基因克隆

(2)构建表达载体pET-28a(+)-pal

(3)转入E.coliJBL21，IPTG诱导表达

(4)SDS-PAGE、Westernblot和酶活测定

(5)重组酶精制

本发明的详细步骤为：

1粘红酵母总RNA提取

(1)挑取粘红酵母单菌落至5mL的种子培养基中于30℃培养24h后，取50μL的种子液至装有50mL培养基的三角瓶中，30℃培养18-20h至生长对数期(OD₆₀₀＝1.0)，1500g离心5min收集菌体，冷水洗涤菌体2次，弃上清。

(2)400μL的TES(10mM Tris-HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，pH7.5)缓冲液重悬细胞，加入400μL酸性酚，剧烈震荡10sec，65℃温育1h，不时用涡旋振荡器短暂震荡。

(3)冰育5min，于4℃，12000g离心5min。

(4)将水相移至另一1.5mL的离心管中，加入400μL酸性酚，剧烈震荡10sec，重复步骤(3)。

(5)将水相移至另一1.5mL的离心管中，加入氯仿，剧烈震荡10sec，于4℃，12000g离心5min。

(6)将水相移到新的1.5mL离心管中，加入40ul的3M NaAc及1ml冰冷的无水乙醇，于4℃，12000g离心5min。

(7)加入1mL的75％乙醇快速震荡洗涤RNA沉淀。

(8)沉淀于无菌操作台上风吹15min至酒精挥发完全，加入经DEPC处理的无菌水50μL重悬，-80℃保藏备用，采用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。

2反转录，获得cDNA

(1)于0.5mL的离心管中加入50ng的总RNA，1μL 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGGG GG-3′)和5’-(T)₂₅VN(N＝A，C，G，T；V＝A，G，Ce，加水至4.75μL混匀。

(2)72℃温育3min后于42℃温育2min，1500g离心10sec。

(3)加入2μL 5×buffer(250Mm Tris-HCl，375mM KCl，30mM MgCl₂)，1μL DTT(20mM)，1μL dNTP(10mM)，0.25μLRNase抑制剂和1μL的反转录酶，42℃温育90min后于70℃处理10min，冷却至室温加入20μL无菌水，获得cDNA。

3 PCR扩增

设计一对特异性引物primer F：5′-GGAATTCCATATGATGGCCCCCTC CGTCGACTCGATC-3′；primer R：5′-CGGAATTCCTAGTATGGTCTACGT CCAAAGG-3′。0.25mL的离心管加入1μL cDNA，primer F和R各1μL，5μL 10×buffer，5μL dNTP(2mM)，0.5μL pfu DNA聚合酶，加去离子水至50μL，94℃预变性4min，94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸2min，25个循环，琼脂糖凝胶电泳检测。

4 构建克隆载体pUCm-T-pal