[发明专利]一种检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，酶联免疫试剂盒中含有：

 (1) 包被有双酚A-BSA包被抗原的96孔酶标板；

(2) 双酚A标准品溶液；

 (3) 双酚A特异性抗体；

 (4) 底物显色液；

 (5) 终止液；

 (6) 浓缩洗涤液；

 (7) 酶标二抗溶液 。

2.如权利要求1所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标板中包被的包被抗原为双酚A半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋；通过Friedel-Crafts烷基化反应在双酚A上引入羧基，制得能够与载体蛋白偶联的双酚A半抗原，再将其与N-羟基丁二酰亚胺和N,N’-二环己基碳二亚胺混合后反应，与载体蛋白偶联制备双酚A完全抗原。

3.如权利要求1所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的双酚A标准品溶液的浓度分别为0μg/L, 0.1μg/L, 0.5μg/L, 1.0μg/L, 3.0μg/L和 10μg/L。

4.如权利要求1所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述双酚A特异性抗体为兔抗双酚A的多克隆抗体，用双酚A半抗原与牛血清蛋白的偶联物作为免疫原通过免疫兔制得。

5.如权利要求l所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液为pH 7.4，含有1%吐温20和0.5%叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求1所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的酶标二抗为羊抗兔IgG。

7.如权利要求1所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗的酶为辣根过氧化物酶，底物显色液A液为过氧化氢，底物显色液B液为四甲基联苯胺溶液，终止液为2mol/L的硫酸。

8.一种样品中双酚A含量的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

第一步，样品前处理：对于较干净的水样可直接测定；对于悬浮物含量较高的包括水样在内的液态样品，取样品使用超滤膜过滤，或者离心处理；对于悬浮物含量很高的样品，先采用粗纤维素膜过滤，再使用细纤维素膜膜过滤；若样品中双酚A含量>20.0μg/L，可用超纯水对样品进行适当稀释后再测定；若样品中双酚A含量<0.2μg/L，采用固相萃取对样品进行适当浓缩再测定；

第二步，用上述的酶联免疫试剂盒进行检测：

a. 将试剂盒从冰箱取出，放置室温下平衡；

b. 将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释，试剂盒上每孔加入洗涤液即可注满；

c. 阴性孔和标准品孔分别加入双酚A标准品：0μg/L， 0.1μg/L， 0.5μg/L， 1.0μg/L， 3.0μg/L， 10.0μg/L；样品孔各加入待测样品；

d. 每孔同时各加入抗双酚A抗体和酶标二抗溶液；

e. 在反应环节，轻轻振摇混匀，室温下反应；

f. 在洗涤环节，甩掉板中液体，每孔加满洗涤液，放置后用力甩掉洗涤液，共洗涤4~5次；

g. 在显色环节，每孔加入底物A溶液后，再同时加入底物B溶液，轻轻振摇混匀，室温下显色；

h. 在终止环节，在每个微孔中加入终止液，终止显色反应，此时蓝色将迅速变为黄色；

i. 轻轻摇动微孔板测定各孔的吸光度；

(3) 分析检测结果：以测定的双酚A标准品的吸光度平均值为纵坐标，以各标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线；将横坐标设置成对数坐标，对标准曲线进行对数拟合，得出方程A = a×lnC + b，得出R²值，计算出各样品孔平均吸光度(A)对应的样品浓度                                               ，其中，A－吸光度   ，a－斜率  ，C－双酚A浓度  ，b－截距，  R2－决定系数，Cs－待测样品双酚A浓度。