[发明专利]一种检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及检验检疫，特别涉及一种用于检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒。

背景技术

双酚A，中文名称2,2-双（4-羟基苯基）丙烷，英文名称2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane或Bisphenol A (简称为BPA)，易溶于醇、丙酮、乙醚、二氯甲烷、苯及稀碱液等，微溶于四氯化碳，几乎不溶于水。BPA是重要的有机化工原料，苯酚和丙酮的重要衍生物，主要用于生产聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂等多种高分子材料。也可用于生产增塑剂、阻燃剂、抗氧剂、热稳定剂、橡胶防老剂、农药、涂料等精细化工产品。

BPA在生产生活中几乎无处不在，从矿泉水瓶、医疗器械到及食品包装的内里，都有它的身影。每年全世界生产2700万吨含有BPA的塑料。但BPA也能导致内分泌失调，威胁着胎儿和儿童的健康。BPA是制造包括婴儿奶瓶、水瓶、其他食品和饮料容器等坚硬和透明聚碳酸酯塑料的关键物质。癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与BPA有关。国内外市售婴儿用聚碳酸酯塑料奶瓶在沸水下检出双酚A析出，可能会危害婴儿的健康；桶装水因为其便利而在人们日常生活普及，已有文献报道在桶装水中检出的双酚A，长期摄入含有双酚A的饮用水会影响健康；而事实上研究表明长期暴露在食品包装物上的双酚A剂量水平要比实验室里双酚A致动物癌变的剂量水平高的多。由于欧盟认为含双酚A奶瓶会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止含生产化学物质双酚A(BPA)的婴儿奶瓶。

随着人们对食品安全意识的提高，由于双酚A在环境中的广泛存在及其危害性。为保障食品安全，开发出快速、有效并能够适应现场检测需要的双酚A残留的检测手段显得尤为重要。

目前现有技术中对双酚A的测定多采用色谱法，但该方法中所用的仪器造价昂贵且耗时较长，样品前处理复杂，而且不能用于现场检测，使其应用范围受到一定的限制。与之相比，ELISA技术在大量样品的现场快速筛选方面有着无可比拟的独特优势。但是目前国内实际应用的检测双酚A的ELISA试剂盒很少，主要依赖进口。因此，本课题致力于研究制备效价高，亲和性好，特异性强的抗体，用于建立BPA免疫分析检测的产品和使用方法。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足，提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够适合大量样本筛查的试剂盒，以及利用其检测水样中双酚A含量的检测方法。本发明提供的酶联免疫试剂盒用于水样双酚A的检测，要能够做到操作简便、费用低廉、灵敏度高并且能够进行现场监控，还适合大量样本筛查。

为了达到上述发明目的，本发明提供的技术的原理和技术方案如下：

一、本发明的检测原理为：

先在酶标板上固定一定量的双酚A偶联抗原，加入样本溶液或双酚A标准品溶液后，接着加入一定量的双酚A特异性抗体，使待测抗原和固定抗原竞争性地与溶液中游离的双酚A特异性抗体结合，充分洗涤未反应的抗体和抗原，再加入一定量的酶标二抗(抗抗体) 进行放大作用，充分洗涤后，加底物显色液显色。结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的抗体越少，酶标二抗的量就越少，显色越浅，两者呈负相关。此实验的条件是：固定抗原限量，抗体定量，酶标二抗限量。固定抗原与待测抗原和抗体结合的位点相同，竞争性地与抗体结合。

二、本发明的技术方案为：

本发明一方面提供了一种用于检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒，它含有：

(1) 包被有双酚A-BSA包被抗原的96孔酶标板；

 (2) 双酚A标准品溶液；

 (3) 双酚A特异性抗体；

 (4) 底物显色液；

 (5) 终止液；

 (6) 浓缩洗涤液；

 (7) 酶标二抗溶液   。  

在本发明检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒中，所述包被抗原为双酚A半抗原与牛血清蛋白的偶联物。通过Friedel-Crafts烷基化反应在双酚A上引入羧基，制得能够与蛋白质偶联的双酚A半抗原，再将其与N-羟基丁二酰亚胺和N,N’-二环己基碳二亚胺混合后反应，与蛋白质偶联制备双酚A完全抗原，

在本发明检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒中，双酚A特异性抗体为兔抗双酚A的多克隆抗体，用双酚A半抗原与牛血清蛋白的偶联物作为免疫原通过免疫兔制得。