[发明专利]一种标准攻击毒株CVS-11的重组病毒及其制备方法

权利要求书

1.一种基于国际标准攻击毒株CVS-11的重组病毒rCVS-11-eGFP，其特征在于：

以国际标准攻击毒株CVS-11反向遗传操作系统为基础，在CVS-11基因组G-L处插入eGFP基因，构建获得表达eGFP的重组病毒rCVS-11-eGFP。

2. 根据权利要求1所述重组病毒rCVS-11-eGFP的制备方法，包括以下步骤：

1）国际标准攻击毒株CVS-11反向遗传操作系统的建立，具体包括全长质粒pcDNA3.1-CVS-11及辅助质粒系统pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-G和pcDNA3.1-L，4个辅助质粒分别表达CVS-11株的核蛋白N、磷酸蛋白P、糖蛋白G和大转录蛋白L，以及应用此系统拯救的重组病毒rCVS-11；

2）在CVS-11反向遗传操作系统基础上，构建CVS-11绿色荧光蛋白重组病毒载体pCVS-11-eGFP，拯救获得重组病毒rCVS-11-eGFP。

3. 根据权利要求1所述重组病毒rCVS-11-eGFP的制备方法，包括以下步骤：

1）建立国际标准攻击毒株CVS-11反向遗传操作系统

提取CVS-11细胞毒的总RNA，反转录获得cDNA；分4段扩增CVS-11全基因组cDNA，通过引物添加酶切位点，将CVS-11基因组的G-L处替换为BssHⅡ、BsiwI和SacⅡ3个限制性内切酶序列；4个扩增片段经多步酶切连接插入到pcDNA3.1的KpnⅠ和NotⅠ处；在cDNA两端加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列；通过单链合成锤头状核酶和丁型肝炎核酶的部分序列，变性退火后形成双链锤头状核酶序列和丁型肝炎核酶序列，并分别插入到pcDNA3.1的NheⅠ-KpnⅠ处和NotⅠ-PmeⅠ处，获得全长质粒pcDNA3.1-CVS-11；构建辅助质粒，克隆CVS-11的核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）基因的开放阅读框（ORF），分别定向克隆至pcDNA3.1，分别得到pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-G和pcDNA3.1-L；pcDNA3.1-CVS-11和pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-G和pcDNA3.1-L共转染NA细胞，经免疫荧光染色鉴定，确定成功拯救到重组病毒rCVS-11；

2）rCVS-11-eGFP的构建及拯救

从pIRES2-eGFP载体上扩增eGFP基因，上下游引物分别添加BsiWⅠ和SacⅡ酶切位点；在CVS-11反向遗传操作系统基础上，经酶切连接，将eGFP基因定向克隆至pcDNA3.1-CVS-11的BsiwI-SacⅡ处，得到重组质粒pCVS-11-eGFP；pCVS-11-eGFP和pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-G和pcDNA3.1-L共转染BHK-21细胞，培养后在荧光显微镜下观察到有绿色荧光蛋白的表达，重组病毒rCVS-11-eGFP拯救成功。

4. 权利要求1所述重组病毒rCVS-11-eGFP作为检测抗原，用于检测动物和人血清中抗狂犬病病毒中和抗体效价，由此建立的一种新型狂犬病病毒中和抗体检测方法。

5. 一种国际标准攻击毒株CVS-11反向遗传操作系统，其特征在于：

包括全长质粒pcDNA3.1-CVS-11及辅助质粒系统pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-G和pcDNA3.1-L，4个辅助质粒分别表达CVS-11株的核蛋白N、磷酸蛋白P、糖蛋白G和大转录蛋白L，以及拯救的重组病毒rCVS-11。