[发明专利]一种标准攻击毒株CVS-11的重组病毒及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明公开一种标准攻击毒株CVS-11的重组病毒（缩写为：rCVS-11-eGFP）同时还提供了该重组病毒的制备方法，用于动物和人血清中抗狂犬病病毒中和抗体的检测抗原，属于生物技术领域。

背景技术：

狂犬病(Rabies)即疯狗病，又称恐水病，是由狂犬病病毒（Rabies Virus）感染温血动物和人而引起、主要侵害中枢神经系统的一种人畜共患性传染病。我国人类狂犬病的传染源中，犬猫占85%-95%，WHO研究表明，70%左右的犬群免疫率能高效阻断狂犬病的传播链。因此，建立完善的动物狂犬病预防体系，时地监测动物机体抗体水平非常重要。

目前，狂犬病病毒中和抗体检测方法主要有：快速荧光灶抑制试验（RFFIT）和荧光抗体病毒中和试验（FAVN）。RFFIT主要用于人疫苗接种后血清样品抗体水平的测定，RFFIT用于检测动物血清样品抗体水平时，尤其当抗体水平较低时，存在一定比例的假阳性；并且在结果判定时受主观因素影响大（需人工准确计算出病毒增殖时形成的荧光灶数量）。OIE推荐采用FAVN对动物血清效价进行测定，检测结果一致性好外，在结果判定时，FAVN受主观因素影响较小，且适合于大规模样品的检测。两种方法均应用标准攻击毒株CVS-11，对实验室条件、操作人员素质要求较高；荧光抗体价格高昂、荧光发光持续时间短，检测成本高；需要丙酮固定，操作步骤繁多，对操作人员有微神经毒性和粘膜刺激。

反向遗传学（Reverse Genetics）是从生物的遗传物质入手，通过有目的、精确地改造基因结构以观察这些改变对表型和性状的直接影响。RNA病毒的反向遗传学技术是指由病毒cDNA克隆获得RNA病毒的一项技术，通过人为操作cDNA，从而实现对RNA病毒基因组的人工操作。反向遗传系统为RNA病毒的分子生物学研究提供了强大的工具。自20世纪70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆构建成功以来，RNA病毒的分子生物学研究取得了快速进展，这很大程度应归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立。

目前，国内外尚未有国际标准攻击毒株CVS-11反向遗传操作系统的报道。国内外尚没有一种真正意义上快速、经济、高效的狂犬病病毒中和抗体的检测方法。

发明内容：

本发明提供了一种国际标准攻击毒株CVS-11的重组病毒，用于检测动物和人抗狂犬病病毒中和抗体效价，建立的一种快速、特异、方便的新型狂犬病病毒中和抗体检测方法。

本发明还公开了国际标准攻击毒株CVS-11的重组病毒的制备方法，适用于工业化生产。

本发明进一步建立了国际标准攻击毒株CVS-11反向遗传操作系统。

本发明公开的基于国际标准攻击毒株CVS-11的重组病毒rCVS-11-eGFP，其特征在于：

以国际标准攻击毒株CVS-11反向遗传操作系统为基础，在CVS-11基因组G-L处插入eGFP基因，构建获得表达eGFP的重组病毒rCVS-11-eGFP。

本发明所述重组病毒rCVS-11-eGFP的制备方法，包括以下步骤：

1）国际标准攻击毒株CVS-11反向遗传操作系统的建立，具体包括全长质粒pcDNA3.1-CVS-11及辅助质粒系统pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-G和pcDNA3.1-L，4个辅助质粒分别表达CVS-11株的核蛋白N、磷酸蛋白P、糖蛋白G和大转录蛋白L，以及应用此系统拯救的重组病毒rCVS-11；

2）在CVS-11反向遗传操作系统基础上，构建CVS-11绿色荧光蛋白重组病毒载体pCVS-11-eGFP，拯救获得重组病毒rCVS-11-eGFP；

3） rCVS-11-eGFP按MOI=0.1接种于BHK-21细胞，经扩大培养，rCVS-11-eGFP病毒滴度可达到10⁹ TCID₅₀/mL，－70℃保存备用。

根据权利要求1所述重组病毒rCVS-11-eGFP的制备方法，包括以下步骤：

1）建立国际标准攻击毒株CVS-11反向遗传操作系统