[发明专利]一种小单孢菌菌株、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种小单孢菌菌株，其特征在于：所述菌株为小单孢菌菌株FIM07-0019(Mciromonospora sp.FIM07-0019)，于2012年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6474。

2.一种如权利要求1所述的小单孢菌菌株的分离方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤100：将2克采集于智利南部43°32′0′S，72°52′0′W，水深20米的海底海泥用无菌陈海水稀释成10^-1和10^-2倍；

步骤200：分别取原液及稀释过的样品悬液0.1mL涂布于燕麦琼脂培养基进行菌种分离，并于30℃下培养2周，得到小单孢菌菌株FIM07-0019。

3.如权利要求2所述的小单孢菌菌株的分离方法，其特征在于：所述燕麦琼脂培养基组分为：燕麦粉2％、琼脂2％、重铬酸钾50mg/L、微量元素溶液0.1ml/100ml，其余成分为水，且所述水包括质量比为1∶1的蒸馏水和海水；所述微量元素溶液包括如下组分：FeSO₄·7H₂O 0.1g，MnCl₂·4H₂O 0.1g，ZnSO₄·7H₂O 0.1g，蒸馏水1000ml。

4.一种利用权利要求1所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)制备小单孢菌菌株FIM07-0019发酵液：将一铂环小单孢菌菌株FIM07-0019的燕麦琼脂斜面培养物接入种子培养基，于温度35℃，转速220rpm/min下培养48h；然后按10％的移种量转入发酵培养基，并于温度28℃，转速220rpm/min下振荡培养96～120h；

(2)提取：将(1)中获得的小单孢菌菌株FIM07-0019发酵液于4500rpm离心15min以获得上清液和菌丝体；所述菌丝体用2倍于菌丝体体积的甲醇浸泡，经减压浓缩后再用水稀释；将稀释液与上清液合并后一起流经大孔吸附树脂Hp-20，再用甲醇洗出并浓缩，最后浓缩物用等体积的乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩，得浸膏状提取物；

(3)分离：将(2)中获得的提取物采用正相硅胶柱层析，用体积比100∶0，98∶2，95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，50∶50，0∶100的氯仿-甲醇溶剂梯度洗脱，薄层层析检测，并收集Rf值为0.6的馏份；再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用体积比1∶1的甲醇-氯仿洗脱，薄层层析检测，并收集Rf值为0.6的馏份；再经C₁₈反相柱层析，以甲醇-水梯度洗脱，流速为1ml/min，且所述甲醇-水梯度为：甲醇含量在30min内从0到100％；薄层层析检测，并收集Rf值为0.6的馏份；再将馏份经制备型高压液相色谱进行分离，以60％乙腈溶液洗脱，流速为1.5ml/min，得到大环内脂类化合物。

5.如权利要求4所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于：所述薄层层析的展层剂为体积比9∶1氯仿-甲醇溶剂。

6.如权利要求4所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于：所述种子培养基的组分为：可溶性淀粉1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl 0.05％，(NH₄)₂SO₄0.05％，K₂HPO₄ 0.05％，CaCO₃ 0.1％，蒸馏水配制，pH为7.5；且所述种子培养基中各组分的百分数均为质量分数。

7.如权利要求4所述的小单孢菌菌株制备大环内脂类化合物的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，花生饼粉2.0％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，K₂HPO₄ 0.05％，CaCO₃ 0.1％，蒸馏水配制，pH为7.5，且所述发酵培养基中各组分的百分数均为质量分数。

8.一种利用权利要求1所述的小单孢菌菌株制备的大环内脂类化合物，其特征在于：结构式如下：