[发明专利]含蛋白转导域的融合多肽突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及含有蛋白转导域TAT、Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)的融合多肽突变体，还涉及编码该融合多肽突变体的cDNA序列及其衍生物，包含此类cDNA序列的重组表达载体，用此类重组表达载体转化的宿主细胞，以及用于制备此类重组蛋白质和它们的衍生物的方法。本发明还涉及该融合蛋白突变体的构建方法及其应用。

背景技术

肾脏纤维化是不同病因(包括炎症、损伤、药物、糖尿病和遗传因素、衰老等)所导致慢性肾脏疾病的最终共同结局。各种进展性肾脏疾病，无论其原发病如何，最终都将导致肾脏纤维化，进展为终末期肾功能衰竭，并必须依靠透析或肾移植维持生命。因此，研究肾脏纤维化的发病机制、探索能够缓解肾脏纤维化进程或逆转肾脏纤维化的有效治疗手段、延缓终末期肾衰的发生是肾脏疾病研究领域亟待解决的重要临床问题。

近年来研究发现，在众多细胞因子、体液、代谢和血流动力学因素中，转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)和骨形态发生蛋白(bone morphorgenic protein，BMP)及其下游的smad信号转导通路在肾脏纤维化发生发展中起着决定性作用。通过阻断TGF-β1信号转导通路和(或)增强BMP7信号来逆转或延缓肾脏纤维化成为当前研究的热点，并已在大量的体外及动物实验中得以证实。但目前已经建立的阻断TGF-β1信号转导通路的策略在抑制肾脏纤维化的同时也对机体对抗肾脏炎症的作用通路产生了抑制作用，因此难于在临床推广应用。BMP7在治疗急性和慢性肾脏疾病中虽显示出良好的效果，然而BMP7的活性形式为二聚体，含有6个分子内二硫键和一个分子间二硫键，使用基因工程技术制备时蛋白复性成本过高，不能被广大患者接受。

从2009年始，本课题组一直致力于探索TGF-β1通路抑制蛋白SARA阻断肾纤维化的作用研究，探索能够替代基因治疗及BMP7并能有效治疗、缓解肾脏纤维化的蛋白药物。合成的SARA融合蛋白虽具一定的功能活性，但蛋白表达不稳定，以包涵体形式存在，沉淀蛋白须经复性才可使用，但复性常使蛋白性质发生变化而失去功能，不利于今后的药物生产。

发明内容

本发明的目的在原有SARA融合蛋白的工作基础上，对SARA羧基末端的Smad结合作用域——SARA肽适体(SARA/SBD)进行改造，获得一种含蛋白转导域TAT、Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)的新的融合多肽突变体。

其中，所述蛋白转导域TAT为人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)的反式激活蛋白(transactivator of transcription，TAT)改造而来，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1(YARAAARQARA)。其中，Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)与人SARA/SBD同源，其突变体是通过将Smad锚定与受体活化蛋白SARA肽适体(SARA/SBD)氨基酸序列的第51位由A突变为T以及第54位由A突变为P而获得的；该突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：2(MSASSQSPNPNNPAEYCSTIPPLQQAQASGALSSPPPTVMVPVGVLKHPGTEVPQPR)。其中，所述连接肽包含至少1个、3个、5个、7个、9个、15个、25个氨基酸，如其氨基酸序列为SGGGS(SEQ ID No：3)。

本发明还涉及该融合蛋白突变体的氨基酸序列，如SEQ ID NO：4所示(YARAAARQAR ASGGGSMSAS SQSPNPNNPA EYCSTIPPLQ QAQASGALSS PPPTVMVPVG VLKHPGTEVP QPR)；本发明还涉及编码该融合蛋白突变体的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；以及该核酸分子的cDNA序列；该核酸分子或其cDNA与启动子构建的表达盒；包含该核酸分子、或其cDNA、或其表达盒的质粒或载体，其中该质粒或载体是表达载体；还涉及宿主细胞，其包含该核酸分子、cDNA序列、表达盒、或质粒或载体。

本发明还涉及制备该融合蛋白突变体的方法，其中所述方法包括：1)提供核酸，所述核酸包含可在生物中表达的编码所述融合蛋白突变体的核苷酸序列；2)在所述生物中表达所述核酸以形成TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体；和3)纯化所述TAT-SARA/SBD融合蛋白突变体。