[发明专利]体外制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法

权利要求书

1.一种制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法，所述双层类病毒颗粒包含轮状病毒VP2蛋白和VP6蛋白，所述方法包括以下步骤：

a)在原核表达系统中以可溶形式表达VP6，并进行纯化，纯化后的VP6蛋白保持其正确构象，以三聚体形式存在；

b)将纯化后的VP6与非颗粒状态的VP2共组装形成双层颗粒2/6-VLP；

其中所述双层类病毒颗粒2/6-VLP的组装包括将VP6和VP2蛋白混合后，将缓冲液更换至组装缓冲液而组装成双层类病毒颗粒，其中：

i)VP2、VP6为未组装成颗粒的纯化的蛋白，其纯度为95％以上；

ii)组装缓冲液为磷酸盐缓冲液，MES缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，其pH介于4.0～6.4；

iii)组装缓冲液含150mM～2M的NaCl；

iv)VP2和VP6的质量比介于1：1～1：10。

2.权利要求1的方法，其中所述VP6蛋白通过以下步骤制备：

1)在大肠杆菌中表达轮状病毒VP6蛋白；

2)向含VP6蛋白的裂解上清中加入聚乙烯亚胺或二价或三价金属离子，以沉淀核酸和部分杂蛋白，聚乙烯亚胺的浓度介于0.05％-0.2％；金属离子选自Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺和Al³⁺；金属离子的浓度介于10～80mM；

3)离心，使蛋白质上清液经历盐析和色谱层析纯化。

3.权利要求2的方法，其中所述盐析使用饱和硫酸铵进行。

4.权利要求2的方法，其中所述色谱层析选自疏水相互作用色谱和离子交换色谱。

5.权利要求1的方法，其中所述VP2蛋白是通过以下步骤制备的非颗粒状态的VP2蛋白：

1)在大肠杆菌中表达轮状病毒VP2蛋白；

2)向含VP2蛋白的裂解上清中加入聚乙烯亚胺，聚乙烯亚胺的浓度介于0.05％-1％；

3)离心，使蛋白上清液经盐析和色谱层析纯化。

6.权利要求5的方法，其中所述盐析使用硫酸铵进行。

7.权利要求5的方法，其中所述色谱层析选自离子交换色谱和疏水相互作用色谱。

8.权利要求2的方法，其中所述聚乙烯亚胺的浓度是0.1％。

9.权利要求2的方法，其中所述金属离子为Ca²⁺，其浓度是20mM。

10.权利要求4的方法，其中色谱层析是疏水作用色谱：3M NaCl条件下经GE的PhenylHP，其中核酸穿透，VP6蛋白在2M NaCl条件下洗脱，杂蛋白在无盐条件下洗脱。

11.权利要求5的方法，其中所述聚乙烯亚胺的浓度是0.5％。

12.权利要求7的方法，其中色谱层析是阳离子交换色谱：在pH为8.0的Tris-HCl条件下通过GE的SP FF进行纯化，其中核酸和部分杂蛋白穿透或在150mM NaCl条件下洗脱，VP2蛋白在500mM NaCl条件下洗脱。

13.权利要求1的方法，其中pH为6.4。

14.权利要求1的方法，其中组装缓冲液含300mM NaCl。

15.权利要求1的方法，其中，VP2和VP6的质量比为1：2.6。