[发明专利]体外制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法

说明书

本发明涉及轮状病毒双层类病毒颗粒的制备方法，包括从裂解上清中纯化轮状病毒VP6蛋白，由VP2蛋白和VP6蛋白构成的双层类病毒颗粒的体外组装，所述蛋白和类病毒颗粒可用于预防或减轻轮状病毒感染导致的临床症状。

技术领域

本发明涉及生物化学、分子生物学和分子病毒学领域，具体的，本发明涉及轮状病毒的结构蛋白VP6蛋白，其制备方法，以及包含其的类病毒颗粒体外组装的方法，所述蛋白及其类病毒颗粒可用于预防或减轻轮状病毒感染所导致的腹泻。

背景技术

轮状病毒(rotavirus,RV)属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，是引起婴幼儿腹泻的主要病原体，1973年Bishop在胃肠炎病人十二指肠发现(Bishop,Davidson et al.1973)。研究表明，95%以上的儿童在5岁前至少感染过一次轮状病毒，据WHO统计，每年因轮状病毒感染而导致的死亡高达60万，而腹泻病例则高达2亿，仅在美国，每年因轮状病毒感染而造成的经济损失就高达1亿美元(Hsu,Staat et al.2005;Tate,Burton et al.2011)，造成严重的经济负担和社会负担。

轮状病毒为无包膜RNA病毒，基因组由11条双链RNA组成，分别编码6种结构蛋白(VP1-VP4，VP6和VP7)和6种非结构蛋白（NSP1-NSP6）(Estes and Cohen 1989)。轮状病毒为二十面体对称，其衣壳由三个同心层构成，即由VP1、VP2和VP3构成的核心层，由VP6构成的内衣壳，以及由VP4和VP7构成的外衣壳。其中VP6为组特异性抗原，根据其抗原性不同可将轮状病毒分为A-G 7个组，其中A组轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体，该蛋白具有较强的免疫原性，尽管不是中和抗原，却能够产生较好的免疫保护效果(Sabara,Frenchicket al.1994)。VP4和VP7为主要中和抗原，根据二者抗原性的不同可将A组轮状病毒分为不同的P血清型和G血清型，根据二者基因的不同可分为不同的基因型。G型和P型相互独立又相互影响，常见的组合包括G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]和G4P[8]，近年来，G9P[8]和G9P[6]的流行显著增加(Li,Liu et al.2009)。

目前尚无针对轮状病毒的特效药，安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段。经过多年的研究，历经单价减毒疫苗，多价基因重配疫苗和基因工程疫苗三个阶段，目前已有四种轮状病毒疫苗相继上市，包括惠氏的四价人-猿基因重配疫苗，兰州所的单价减毒疫苗、默克的五价人-牛基因重配疫苗和葛兰素史克的单价减毒疫苗。但这些疫苗均为减毒活疫苗，存在较大的安全隐患，其中惠氏的疫苗由于肠套叠问题上市半年后即被撤回(Murphy,Gargiullo et al.2001)；默克和葛兰素史克的疫苗尽管经过大量的临床实验证实其安全性和有效性(Bernstein,Sack et al.1999;Vesikari,Matson et al.2006;Linhares,Velázquez et al.2008;Vesikari,Itzler et al.2009;Snelling,Andrews etal.2011)，但在亚洲和非洲等轮状病毒死亡率较高的国家和地区的保护效率远低于欧美等发达国家(Armah,Sow et al.2010;Zaman,Anh et al.2010;Madhi,Cunliffe etal.2011)，且越来越多的证据表明，二者接种后均产生排毒并可导致病毒的水平传播(Anderson 2008;Rivera,Pena et al.2011;Yen,Jakob et al.2011)，也有研究表明，免疫缺陷儿童接种疫苗后可产生严重胃肠炎(Steele,Cunliffe et al.2009;Patel,Hertel etal.2010)；兰州所的疫苗上市十多年，至今尚未发现严重问题，但仅能预防严重腹泻，不能预防轮状病毒的感染(Fu,Wang et al.2007)。因此，尽管轮状病毒减毒疫苗的研究取得了可喜的结果，但也还存在一定的问题，其安全性和有效性还有待进一步提高，发展更加安全、有效的疫苗势在必行。非复制型疫苗是目前轮状病毒疫苗研究的主要方向，其中基因工程疫苗由于成本低，安全、有效等特点而备受关注。